Fig. 1. Aislamiento muscular, para la inyección del tóxico.
Acta Estrabológica 1999
MENGUAL VERDÚ E, HUESO ABANCÉNS JR, BARCELÓ MENDIGUCHÍA A, GARCÍA SÁNCHEZ J
MIOPATÍA RESTRICTIVA: DISEÑO EXPERIMENTALRESUMEN
Objetivos: Presentar un estudio experimental, realizado en conejos albinos, de "Miopatía restrictiva".
Método: Los tóxicos inyectados en el músculo recto superior, han sido: el Etanol al 99% ("Panreac"), el 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate ("TPA") y la Dexametasona fosfato ("Celestone soluble").
Resultados: Tanto con el Etanol como con el TPA se produce a las 72 horas una importante reacción inflamatoria, que da paso a una degeneración fibrosa a las 6 semanas.
Conclusión: Es posible el inducir un modelo experimental de miopatía restrictiva tanto con el TPA como con el Etanol.
PALABRAS CLAVE: Miopatía restrictiva, estudio experimental, TPA, Etanol, fibrosis.
SUMMARY
Purpose: An experimental study of restrictive myopathy done in albinos rabbits is presented.
Methods: The injected toxics in the restrictive myopathy has been etanol at 99%, TPA and Dexametasona fosfate.
Results: Both Etanol and TPA have generate at the 72 hours an important inflammatory reaction which becomes in a fibrosis degeneration in 6 weeks.
Conclusion: It's possible to introduce an experimental pattern of restrictive myopathy with both Etanol and TPA.
KEY WORDS: Restrictive myopathy, experimental study, TPA, Etanol, fibrosis.
INTRODUCCIÓN
La "Miopatía Restrictiva" se caracteriza por la infiltración del tejido retroorbitario de células T y macrófagos, con la liberación de citocinas que estimulan la síntesis de colágeno por los fibroblastos, condicionando no sólo una degeneración fibrosa de las células musculares, sino también una serie de alteraciones a nivel de los septos del tejido conjuntivo fibroso intraorbitario (1).
La resistencia palpable a la elevación mecánica, es decir, la prueba de ducción pasiva positiva, sirve para comprobar que el globo ocular se halla aprisionado por un músculo en tensión.
Presentamos distintos tipos de miopatías experimentales, simulantes de lo que ocurre en los pacientes con miopatía restrictiva (enfermedad de Graves) (2).
MATERIAL Y MÉTODOS
Los animales de experimentación utilizados han sido conejos blancos albinos, de cualquier sexo y de un peso aproximado de 2'5 kg. Escogimos dichos animales por su carácter genético homocigótico. El número total de animales utilizados ha sido de 30.
Para el manejo de dichos animales, se siguieron métodos humanitarios, usando varios tipos de anestesia. Uno de ellos fue la anestesia general con Clorhidrato de Ketamina ("Ketolar"), a razón de 1 cc/kg. de peso y a una concentración de 5 mg/cc También fue empleada anestesia retrobulbar con Bupivacaína ("Scandinabsa") al 2% en dosis de 0'5 cc, para conseguir una aquinesia ocular al principio del estudio; y también, se utilizó anestesia tópica con un compuesto de Clorhidrato de Oxibuprocaína 4 mg. más Clorhidrato de Tetracaína 1 mg en 1 ml de vehículo acuoso ("Colircusí Anestésico Doble").
A lo largo de todo el estudio, durante la manipulación de los animales de experimentación, se han seguido las normas de la C.E.E. y la normativa española que la recoge (B.O.E. del 18 de Marzo de 1988. Orden 7026 y B.O.E. del 25 de Octubre de 1990. Orden 25805).
Para la inyección de los músculos extraoculares con toxina, se prepararon unas soluciones con distintas sustancias: Etanol al 99% ("Panreac"), 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA. "Sigma Co") y Dexametasona fosfato 2 mg ("Celestone Soluble").
El TPA es una sustancia difícil de conseguir y de manipular; ésta se realizó con guantes (doble par) por ser el TPA un producto cancerígeno para la piel, a largo plazo.
Para la inyección de la toxina, procedimos a aislar en cada uno de los animales el músculo recto superior. Para ello, realizamos una incisión conjuntival a nivel limbar superior. Una vez realizada ésta, disecamos cuidadosamente la zona, evitando lesionar tanto el cuerpo muscular como las estructuras adyacentes, e introducimos un gancho de estrabismos. Desplazamos éste en sentido horizontal hasta conseguir alcanzar el músculo recto superior (Fig. 1).
Fig. 1. Aislamiento muscular, para la inyección del tóxico.
La inyección de las sustancias tóxicas la realizamos a 3 milímetros (medida tomada con un compás de estrabismos) de la inserción muscular superior.
Los animales fueron sacrificados con una dosis letal de Pentobarbital ("Eutalender") administrada mediante inyección intraperitoneal.
Los 30 ojos (30 conejos) fueron distribuidos en 4 grupos, dependiendo del tóxico inyectado (Tabla I).
Bajo visualización microscópica, y previa anestesia del animal, se procedió a disecar la conjuntiva y a aislar cuidadosamente el músculo recto superior , liberándolo de sus adherencias y evitando dañar los tejidos circundantes, como la vaina perimuscular o la cápsula de Tenon.
La inyección del tóxico se realizó a unos 3 mm de la inserción posterior del músculo recto superior, utilizando para ello una jeringa Hamilton de 10 microlitros.
Tras la inyección se aplicó en todos los casos un antibiótico tópico ("Tobrex, Colirio oftálmico").
En el Grupo I se administró Etanol al 99% (0'01 ml); en otros 8 conejos (Grupo II) se inyectó 1 microgramo de TPA.
En el Grupo III (Tabla I) al TPA se añadieron 0'5 cc de Dexametasona Fosfato ("Celestone Soluble"), en inyección orbitaria perimuscular.
En 6 de los animales se procedió a inyectar, en los mismos músculos, sólo 10 microlitros de suero fisiológico sirviéndonos éstos como Grupo Control.
Los animales fueron sacrificados, en dos grupos, a las 72 horas y a las 6 semanas. Los ojos fueron enucleados, fijados en una solución de formaldehido al 10%, deshidratados con alcohol, embebidos en parafina y seccionados con un microtomo. Las secciones musculares, de aproximadamente unos 2-4 ml fueron obtenidas del tejido muscular próximos al lugar de la inyección. Se tiñeron con hematoxilina-eosina y se examinaron bajo microscopia óptica.
RESULTADOS
- Estudio Histológico (Tabla II).
La inyección de Etanol produce una marcada inflamación en el tejido muscular; a las 72 horas se puede apreciar cómo el músculo recto superior consigue doblar y hasta triplicar su espesor; a microscopia óptica puede observarse la presencia de importante infiltración inflamatoria, de las fibras musculares, con signos de desestructuración tales como, centralización nuclear, fibras de tamaño irregular y de intensa coloración eosinófila (signo de necrosis tisular). A las 6 semanas, se observa, a nivel microscópico, que la infiltración inflamatoria es mucho menor y que hay un predominio de fibrosis y neovascularización, infiltrando las fibras musculares (necrosis hialina de Zenckel) sobre el resto de hallazgos histopatológicos (Fig. 2).
Fig. 2. Fibrosis (Etanol, a las 6 semanas).
Cuando la sustancia inyectada, fue el TPA, al examinar las muestras obtenidas a las 72 horas, observamos como a nivel muscular se ha producido una reacción inflamatoria ligeramente más acentuada que en el Grupo I (Tabla II). Asimismo, en las muestras obtenidas a las 6 semanas, a nivel microscópico, se observan también fenómenos de centralización nuclear, fibras de tamaño diferentes e irregular y coloración eosinófila. En algunos cortes se observa además cierta infiltración grasa, de difícil interpretación. Comparativamente, con respecto al Grupo I, no existen diferencias inflamatorias significativas; únicamente hemos encontrado una degeneración fibrosa e invasión neovascular, ligeramente más marcada (Fig. 3).
Fig. 3. Degeneración fibrosa por TPA.
Las muestras examinadas del Grupo III (Tabla II) (inyección de TPA más CTS) presentaron ya a las 72 horas una reacción inflamatoria mucho más intensa, proporcionalmente, que el Grupo I y II; con intensa infiltración celular, que llegaba a borrar la histología muscular por digestión y necrosis asociada del tejido (Fig. 4).
Fig. 4. Vascularización, fibrosis e infiltración inflamatoria
(TPA+Celestone).
No se objetivaron lesiones a nivel del tejido muscular, en las muestras histológicas de los casos en los que se procedió a la inyección sólo de suero fisiológico, presentando las fibras musculares, a las 72 horas, un aspecto normal (Fig. 5).
Fig. 5. Fibras musculares normales.
DISCUSIÓN
La Miopatía Restrictiva, que aparece en la enfermedad de Graves puede presentarse con una gama variada de signos y síntomas, que no siempre, en el momento del diagnóstico, se asocian a esta patología.
Histológicamente se ha demostrado, que la célula diana principal de todo este proceso anatomo-patológico es el fibroblasto del tejido retrobulbar (3).
Experimentos iniciales mostraron que la producción de glucosaminglicanos por fibroblastos retrooculares aumentaba cuando éstos se cultivaban con linfocitos; y éstos alcanzaban mayores valores, si las células T eran estimuladas por mitógenos (4); tales aseveraciones, coinciden con los efectos, hoy bien reconocidos, que ejercen las citosinas derivadas de las células T y de los macrófagos.
Y dentro del complejo espacio retrobulbar, las estructuras "claves" de esta patología, la constituyen los M.O.E. Son en ellos donde se manifiestan las alteraciones derivadas de los cambios histológicos, evolutivamente. Esto se puede comprender, si se tiene en cuenta que, en comparación con el músculo esquelético, la musculatura extraocular presenta más husos, más tejido conjuntivo intersticial y un importante riego sanguíneo; éste último presenta variaciones inter-individuales e inter-musculares, lo que explicaría la asimetría en la presentación clínica de esta patología.
Experimentalmente, comprobamos que es posible el inducir un modelo de inflamación en la M.O.E., que semeja histológica y evolutivamente al provocado por el TPA (único tóxico descrito para inducir este tipo de patología orbitaria experimental), con el Etanol.
Las miositis inducidas por TPA y Etanol son histológicamente casi semejantes. Ambas pasan por una fase de inflamación seguida de hialinización y fibrosis, hechos semejantes a la miositis de Graves. Sin embargo, la mayor necrosis inducida por los CTS perimusculares apuntan hacia un mecanismo etiopatogénico tóxico y por tanto lo descalifican como modelo experimentalmente útil para el ensayo de terapéuticas extrapolables a los pacientes oftalmo-tiroideos.
BIBLIOGRAFÍA
1. Kroll AJ, Kuwobara T: Dysthyroid ocular myopathy: anatomy, Hystology, and electeron microscopy. Arch. Ophthalmol. 1986; 76: 244-257.
2. Fells P: Oftalmopatía tiroidea: maneja clínico. The Lancet. 1991; 338: 29-32.
5. Campbell RJ: Inmunology of Graves: retrobulbar histology and histochemistry. Acta Endocrinol. 1989; 121: 9-16.
6. Jacobson DH, Gorman CA: Endocrine ophtalmopathy: current ideas concerning a etiology, patogenesis and treatment. Endoc Rv. 1994; 5: 200-220.