53.1. INTRODUCCIÓN
53.2. TÉCNICAS PARA LA TOMA DE MUESTRAS
53.2.1. Paracentesis de cámara anterior
53.2.2. Aspirado vítreo con aguja
53.2.3. Vitrectomía: una vía versus tres vías; suero versus aire53.3. PROCESADO DE MUESTRAS
53.4. MÉTODOS INDIRECTOS: SEROLOGÍA INTRAOCULAR
53.5. MÉTODOS DIRECTOS:
53.5.1. Citología
53.5.2. Cultivos
53.5.3. Reacción en cadena de la polimerasa (RCP)5.3.1. Introducción
5.3.2. Manipulación y procesado de muestras
5.3.3. Ventajas e inconvenientes
53.1. INTRODUCCIÓN
En los pacientes con SIDA la causa principal de uveítis posterior es la retinitis CMV, seguida en frecuencia por las necrosis herpéticas y toxoplasmosis, siendo el resto de cuadros ocasionales e incluso excepcionales.
Aunque el diagnóstico diferencial está basado fundamentalmente en el aspecto oftalmoscópico típico de las lesiones, cada vez son más frecuentes las retinitis necrotizantes atípicas que pueden ser causadas por cualquier virus de la familia herpética (CMV, zóster, herpes simple, etc.), pero también por el toxoplasma, la sífilis o ser la forma de presentación de un linfoma. Por otro parte, es oftalmoscópicamente muy difícil distinguir si una coroiditis es de etiología tuberculosa, o producida por Pneumocystis carinii o criptococo.
Estas dudas de diagnóstico clínico no pueden resolverlas las exploraciones habituales de laboratorio como son las serologías, al ser falsamente negativos hasta incluso los test habitualmente concluyentes en los pacientes inmunocompetentes (p.e. serología luética).
Tampoco debemos olvidar que en los pacientes sin infección por VIH la enfermedad sistémica asociada orienta el diagnóstico de la uveítis; pero en el SIDA las enfermedades sistémicas asociadas pueden ayudar a errar más que a orientar el diagnóstico, dado la habitual coexistencia de múltiples infecciones simultáneamente en diferentes territorios en los estadios avanzados de la enfermedad. Así por ejemplo, es posible encontrar en un individuo con antecedentes de neumonía por Pneumocystis carinii, tuberculosis diseminada extraganglionar y toxoplasmosis cerebral, que la causa de su retinitis y vitritis asociada es un linfoma intraocular, sólo diagnosticable al realizar estudio citológico en el curso de una vitrectomía diagnóstica.
La habitual bilateralidad y frecuente evolución hacia la ceguera de estas uveítis (necrosis macular, desprendimiento de retina, atrofia óptica), no permiten retrasos en el diagnóstico y en el inicio del tratamiento. Pero no es posible intentar cubrir con un tratamiento «a ciegas» todas las posibles etiologías barajadas al realizar el diagnóstico de cada caso concreto. Esto es debido a la alta toxicidad medular, renal y hepática de los fármacos que se van a tener que utilizar sobre individuos ya muy deteriorados, y con intolerancias particulares (p.e. alta frecuencia de alergias a las sulfamidas, etc.).
En estos casos de uveítis de difícil diagnóstico diferencial que amenazan la agudeza visual y que no responden a un tratamiento empírico, puede ser de gran utilidad el análisis de los fluidos intraoculares, conjunto de técnicas menos invasivas que la biopsias coriorretinianas.
En el presente capítulo expondremos las técnicas de toma de muestras de humor acuoso y de vítreo, así como el procesado básico de las mismas para la realización de los estudios de serología, citología, cultivos y las nuevas técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa que están revolucionado el diagnóstico de las uveítis infecciosas.
53.2. TÉCNICAS PARA LA TOMA DE MUESTRAS
53.2.1. Paracentesis de cámara anterior
Previamente a la toma de muestra de humor acuoso se debe instilar colirio anestésico, esperar unos segundos y lavar con colirio de povidona yodada al 10% (Betadine®). Se espera unos 3 minutos con los ojos cerrados y se vuelve a instilar colirio anestésico. Colocado el paciente en la lámpara de hendidura, con la mirada a la derecha si el oftalmólogo es diestro, se realiza la punción con jeringa de 1 ml (insulina) -cuyo émbolo previamente se ha desatascado- conectada a una aguja ultrafina de calibre 30 G. Se punciona a nivel límbico corneal, en el cuadrante inferior penetrando horizontalmente en cámara anterior. El ayudante realiza una aspiración manual hasta obtener un mínimo de 0,2 ml de humor acuoso, aunque pueden llegar a obtenerse más de 0,4 ml. No debe intentar reponerse el fluido de la cámara anterior: ésta se rehará en pocos minutos, permitiendo una nueva toma al día siguiente. Se instila un antibiótico tópico y se ocluye el ojo durante unas horas. Es una técnica sencilla y sin complicaciones.
En pacientes ansiosos que no colaboran en la lámpara de hendidura, se puede realizar esta técnica en quirófano bajo el microscopio colocando al paciente en posición de decúbito supino, o en una simple camilla de exploración con una buena iluminación. Uilizando anestesia tópica o subconjuntival, un blefarostato y sujección del globo ocular con unas pinzas.
53.2.2. Aspirado vítreo con aguja
Se realiza con anestesia peribulbar. Se hace una incisión radial en conjuntiva, y una esclerotomía a 4 mm (fáquicos), con introducción de una aguja de calibre de 20 a 22 G conectada a una jeringa de 5 ml. El ayudante realiza una aspiración manual de 0.5 ml. Se cierra la esclerotomía con nylon 8/0.
Se considera que la aspiración directa del vítreo preserva el especimen mejor, pero como los pacientes con SIDA son jóvenes y tienen por ello un vítreo bien estructurado y compacto, el riesgo de que las tracciones produzcan roturas retinianas hace que esta técnica se reserve sólo para la obtención de cultivos en casos de endoftalmitis endógenas.
53.2.3. Vitrectomía: una vía versus tres vías; suero versus aire (1-5)
La velocidad de corte de la guillotina clásicamente se consideraba que debía ser menor de 300 cpm para evitar el daño de las membranas celulares, aunque estudios recientes no han encontrado alteración de las muestras con 600 cpm.
La vitrectomía utilizando una única vía se realiza con la misma técnica del aspirado vítreo pero en lugar de introducir una aguja, se introduce un vitreotomo conectado a una jeringa de 5 ml. Se realiza una aspiración mecánica de 0,5 ml de humor vítreo no diluido. El ayudante debe evitar el colapso intraocular mediante la presión externa con un instrumento romo. Es una técnica peligrosa en manos no expertas y no la aconsejamos.
La vitrectomía con tres vías es técnicamente más segura y más recomendable. Permite obtener un mayor volumen de vítreo (hasta 2-3 ml), teniendo al mismo tiempo fines terapéuticos (eliminación de la turbidez vítrea e inflamación intraocular, reparación de desprendimientos, etc.). Es especialmente importante antes de abrir la entrada de aire o suero visualizar la punta de la cánula de infusión dentro del vítreo. Si la punta de la cánula está tapada por una fibrosis de la base, debe liberarse con un cuchillete a través de la esclerotomía opuesta, o de lo contrario se producirán desprendimientos de retina y coroides difíciles de reparar.
La vitrectomía bajo infusión de suero dará lugar a una muestra diluida que requerirá filtrado previo a su estudio. Por ello creemos que la técnica de biopsia vítrea de elección es la vitrectomía a tres vías bajo infusión directa de aire colocando el vitreotomo sobre la papila, pues permite obtener grandes cantidades de vítreo sin diluir. El gran inconveniente de esta técnica es la mala visualización por los reflejos que induce el aire intraocular. Ello puede evitarse en parte utilizando sistemas de lentes de campo amplio acopladas al inversor de imagen del microscopio.
El análisis del vítreo es más frecuentemente diagnóstico que el del humor acuoso, pero también técnicamente más complejo (equipo de vitrectomía, etc). Por ello se reserva esta técnica para casos graves (ojos únicos, disminución importante de la visión, sospecha de linfoma, etc.), y/o para pacientes en los que la vitrectomía debe realizarse con fines terapéuticos (opacidades y tracciones vítreas, reparación de un desprendimiento de retina asociado, etc.).
53.3. PROCESADO DE MUESTRAS
Los métodos de diagnóstico intraocular pueden clasificarse en:
• Métodos indirectos, basados en detectar la reacción inmunitaria específica del huésped frente al agente infeccioso (anticuerpos, inmunoglobulinas).
• Métodos directos que identifican el germen (citología, cultivo) o parte de él, como lo es su secuencia genética particular o ADN específico (RCP).
En los pacientes con SIDA, debido a la alteración en la función de los linfocitos B y a la activación policlonal inespecífica de los mismos, la seguridad diagnóstica de los métodos directos sobre los métodos indirectos es todavía mayor que en los individuos inmunocompetentes con uveítis.
La muestra se debe dividir en cuatro fracciones:
• La primera fracción se procesa para la realización de varias determinaciones de sospecha de RCP.
• La segunda fracción acompañada de una toma simultánea de suero se remite al laboratorio de Microbiología para la realización de serología intraocular y sérica, determinando el coeficiente de Goldmann-Witmer-Desmonts.
• La tercera para citología, útil sobre todo para el diagnóstico de toxoplasmosis y linfoma intraocular.
• La cuarta para cultivo de virus, bacterias aerobias y anaerobias y hongos, útil sobre todo para el diagnóstico de endoftalmitis endógenas no tipificadas.
Como las fracciones deben ser como mínimo de 0,1 ml, en el caso del humor acuoso no existirá bastante muestra, debiendo seleccionarse las fracciones que más nos interesan, o realizando una nueva toma al día siguiente.
53.4. MÉTODOS INDIRECTOS: SEROLOGÍA INTRAOCULAR (5-11)
La simple determinación de los anticuerpos en el suero puede ser equívoca para el diagnóstico de lesiones intraoculares en los pacientes con SIDA debido a que:
• Coexisten múltiples infecciones sistémicas que pueden no ser responsables del cuadro ocular, con serologías positivas simultáneamente frente a diferentes gérmenes.
• Estos pacientes asocian una anomalía funcional de los linfocitos B, y frecuentemente una activación policlonal inespecífica de los mismos, negativizándose serologías que en condiciones inmunológicamente normales serían positivas (falsos negativos), o, más infrecuentemente, positivizándose o incrementándose extraordinariamente sin causa justificada títulos de anticuerpos que eran débilmente positivos (falsos positivos).
Así, es frecuente encontrar serologías negativas en muchos pacientes SIDA con extensas áreas de herpes zóster cutáneo, y en más del 20% de casos con toxoplasmosis cerebral confirmada por biopsia.
Será por tanto de mayor utilidad demostrar la producción local ocular de estos anticuerpos. Inicialmente Witmer propuso determinar el nivel de anticuerpos (AC) en humor acuoso o vítreo. Cuando éste era superior al nivel de anticuerpos plasmáticos (> a 1), se consideraba que existía producción local de los mismos. Pero la propia inflamación al aumentar la permeabilidad de la barrera hematoocular puede aumentar el nivel local de todos los anticuerpos y de todas las proteínas a nivel del humor acuoso o vítreo, induciendo muchos falsos positivos. Por ello empezaron a exigirse cocientes mayores para considerar positividad: índice positivo de Goldmann-Witmer superior a 3 (literatura inglesa), o índice de Desmonts superior a 4 (literatura francesa); y aplicando un factor corrector que valorará la rotura de la barrera hematoocular. Si el nivel intraocular de albúmina, proteína que no se sintetiza a nivel ocular, es cercano o incluso superior al 50% de su concentración sérica, indica que la rotura de la barrera hematorretiniana/hematoacuosa es muy grande, existiendo tal número de falsos positivos que estos índices se consideran no valorables.
Un ejemplo de estos índices aparece en la tabla 1.
Estos índices, ya poco específicos, lo son todavía menos en los pacientes con SIDA debido a las alteraciones funcionales de sus linfocitos B ya comentadas: lo que origina un mayor número de falsos negativos que en los pacientes inmunocompetentes.
Además estos índices NO permiten el diagnóstico precoz: no son positivos hasta las 2-4 semanas desde el inicio de la infección, al no haberse sintetizado aún las inmunoglobulinas correspondientes; y tampoco lo son si han pasado meses, al haber disminuido los títulos serológicos hasta niveles casi indetectables. Es decir, si llegan a positivizarse lo harán cuando a nivel clínico se haya observado ya la mejoría del tratamiento empíricamente seleccionado. Por ello, en las fases precoces de la infección, que es cuando en la práctica clínica necesitaremos ayuda en la orientación diagnóstica, resultará más útil la detección directa del ADN del microorganismo mediante la técnica de RCP.
No debe olvidarse la posible reacción cruzada de anticuerpos dentro del grupo herpes (p.e. retinitis CMV con serología positiva también frente a herpes simple, zóster, etc.); siendo frecuente que la positividad del índice ocurra sólo en uno de los dos territorios. En menos de la mitad de los casos el índice resulta positivo simultáneamente en humor vítreo y humor acuoso.
Es difícil establecer el exacto valor diagnóstico de la serología intraocular en los pacientes con SIDA, debido a que la mayoría de series publicadas (7-11) mezclan pacientes inmunocompetentes y pacientes con SIDA, dando la sensibilidad y especificidad diagnóstica del índice de manera conjunta, y sin especificar en los pacientes con SIDA el nivel inmunológico en que se encuentran. Pero en términos generales puede considerarse que en las retinitis necrotizantes el índice de Goldmann-Witmer-Desmonts para la identificación de herpesvirus (CMV, Zóster) y toxoplasma, tiene una especificidad del 90-100% y una sensibilidad media del 78% variable dependiendo del subgrupo de pacientes estudiado (20-50% en el SIDA, 80% en otras causas de inmunodepresión y 92% en pacientes inmunocompetentes) y del germen analizado, siendo de mayor a menor: toxoplasma, herpes zóster y CMV.
Kilstra y cols. (7) en el caso concreto de la toxoplasmosis encontraron en una serie mixta de pacientes (inmunocompetentes y SIDA) una sensibilidad de la técnica del 74% y especificidad del 100%, permitiendo curar lesiones inicialmente diagnosticadas como retinitis CMV refractarias al tratamiento. Pero en otras series -incluyendo nuestra propia experiencia- su sensibilidad puede ser inferior al 30%, influyendo de manera determinante el momento cronológico de la toma de la muestra y la especialización del personal de laboratorio. En el caso concreto de la identificación del herpes zóster en el Síndrome de Necrosis Retiniana estos mismos autores10 encontraron una sensibilidad de la técnica del 57%, aunque el único caso de la serie en paciente SIDA el índice resultó negativo.
En resumen, puede afirmarse que, aunque útil, la determinación aislada del índice de Goldmann-Witmer-Desmonts en pacientes con SIDA (toxoplasmosis, CMV, herpes zóster) tiene en general un escaso rendimiento diagnóstico, siendo preferible la determinación de la RCP o la combinación de ambas pruebas.
53.5. MÉTODOS DIRECTOS
53.5.1. Citología
El humor acuoso tiene poco interés citológico debido al pequeño volumen de la muestra y a la dificultad para obtener concentrados celulares. No obstante, resulta muy útil en los síndromes mascarada por linfoma intraocular.
El humor vítreo contiene una baja proporción en solutos orgánicos, por lo que es un mal medio para la conservación celular, exigiendo que se realicen exámenes en fresco. Si el vítreo es muy denso se pueden realizar extensiones directas. En estos casos la centrifugación no es útil al quedar las células atrapadas en los fragmentos del vítreo, aunque esto se puede paliar si se realiza una digestión previa con hialuronidasa.
Si el vítreo es fluido se puede concentrar mediante:
1) Filtros de membrana Millipore o Poretec. Este último permite obtener una mayor cantidad de células a partir de una cantidad pequeña de humor.
2) Citometría de flujo, que permite cuantificar el número total, tamaño y tipo de células, así como el índice de proliferación celular.
3) Citocentrifugación de muestras no diluidas, a 700 G durante 5 minutos, lo que produce extensiones ricas en células y bien preservadas.
Si la muestra estaba diluida puede centrifugarse a 3000 G durante 5 minutos y parte del sedimento puede resuspenderse y citocentrifugarse otra vez, mientras que el resto puede utilizarse en la elaboración de bloques celulares. Estos bloques celulares formados utilizando un fijador (formol, alcohol, Bouin) y sustancia solidificadora (plasma, trombina, agar, etc ), permiten tratar el material como una biopsia cualquiera (4).
Las tinciones de rutina para el estudio citológico de las extensiones son las de Papanicolau, Giemsa, o Romanowski. En los bloques celulares se pueden aplicar técnicas inmunohistoquímicas, de microscopía electrónica, citogenética y RCP «in situ» para identificar material genético de agentes infecciosos (12-15).
Es fundamental trasladar con rapidez la muestra tras su extracción al laboratorio (entrega «en mano») y contar con un patólogo experto. En pacientes con SIDA el estudio citológico del vítreo puede ser útil sobre todo en la toxoplasmosis, linfoma intraocular, y en la orientación terapéutica inicial de una endoftalmitis endógena (hifas, etc.).
53.5.2. Cultivos
El cultivo del aspirado del humor acuoso o vítreo puede permitir identificar bacterias, hongos o virus, pero debido al pequeño volumen de muestra y al lento crecimiento de algunos gérmenes (semanas), muchas muestras pueden resultar negativas, o positivas cuando el cuadro ya ha curado o cuando el paciente ha perdido irreversiblemente la visión. Actualmente la RCP ha sustituido en la práctica clínica a los cultivos clásicos debido a que es una técnica muy sensible, específica, necesita menos del 50% de ADN del necesario para un cultivo positivo y nos puede dar un diagnóstico en menos de 24 horas, permitiendo modular el tratamiento en función del resultado, y evitando los abundantes falsos negativos que tenían los cultivos del humor acuoso y vítreo.
53.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa
5.3.1. Introducción
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) (16) es un método de amplificación enzimática «in vitro» de secuencias del ADN, que nos permite disponer de grandes cantidades del mismo para su posterior estudio molecular. Utiliza unos oligonucleótidos sintéticos («primers» o cebadores), que se hibridan de forma específica con las cadenas del ADN de la célula o germen investigado flanqueando la región genética de interés. Después de 35-40 amplificaciones se obtiene un material genético «copiado», que si se corresponde con el peso molecular del germen buscado nos da un diagnóstico de certeza.
Es una técnica extremadamente sensible y específica, siendo capaz de detectar ADN a partir de una sola célula. Así por ejemplo, la RCP en la detección del VIH en sangre presenta una sensibilidad del 99% y una especificidad media del 95% (17) (90% al 100%). A nivel oftalmológico ha permitido identificar el VIH en los diferentes tejidos oculares (retina, vítreo, esclera, córnea, etc) (18,19). Hoy en día la técnica resulta fiable para identificar a nivel intraocular a los siguientes patógenos que pueden afectar a los pacientes con SIDA: CMV, herpes zóster, toxoplasmosis, sífilis y tuberculosis. Las técnicas de detección de los virus Epstein-Barr y herpes simple presentan todavía muchos falsos positivos y no deben ser utilizadas para evaluar posibles patógenos a nivel intraocular. Tampoco la RCP es hoy una técnica útil en la identificación de bacterias, con la excepción de la micobacteria tuberculosa.
También puede ser utilizada para identificación de células linfomatosas sobre muestras de biopsias intraoculares previamente fijadas en parafina, siendo más rápida, de menor coste y requiriendo menos material que las técnicas inmunohistoquímicas.
5.3.2. Manipulación y procesado de las muestras
La toma de muestras de humor acuoso y humor vítreo se realiza según las técnicas detalladas anteriormente. Dada su gran sensibilidad se debe evitar que se contamine con sangre durante la aspiración intraocular, manipulando siempre el material con guantes estériles. Una vez tomada la muestra se debe trasladar rápidamente al laboratorio de Microbiología donde se congela a -70ºC hasta el momento del procesado (20-25).
El proceso consta de tres pasos fundamentales (fig. 1) (fig. 2):
1) Desnaturalización térmica de la muestra (ADN molde) mediante su calentamiento a 95ºC,
2) Hibridación de los «primers» con el molde
3) Síntesis del ADN complementario mediante la enzima polimerasa.
La amplificación se consigue al repetir entre 20 y 30 veces el proceso anterior, obteniéndose varios millones de copias de la secuencia buscada o «amplicones». Sólo resta detectarlos.
Existen diferentes técnicas para detectar los amplicones, siendo la más simple y utilizada la electroforesis en gel que contiene una determinada concentración de agarosa en función del peso molecular de los amplicones a analizar. Por su naturaleza el ADN migra hacia el polo positivo. Los resultados se visualizan colocando el gel en un transiluminador de luz ultravioleta, comprobando su identidad mediante la utilización de un marcador de peso molecular y unos grupos control (fig. 3) (fig. 4).
Otra forma de detección de los amplicones es la utilización de sondas específicas marcadas radioactiva o enzimáticamente, con lo que se palia la deficiencia que presentaba esta técnica: la escasez de genoma inicial.
Al tener una altísima sensibilidad, esta ventaja también puede ser un inconveniente si no se aplican con rigor una serie de precauciones: utilización de material estéril, cambio frecuente de guantes, utilización de campana de flujo laminar, etc., dando la técnica falsos negativos (por exceso de material genético) y positivos (por contaminación) en laboratorios no especializados.
El punto crucial de esta técnica es la elección de la zona genética a amplificar, pudiendo por tanto variar su sensibilidad según el «kit» comercial empleado. Los «primers» utilizados en el caso del toxoplasma derivan del gen B1, en el CMV de los genes MIE y gB, y para el Zóster de la región codificante de la glicoproteína I y del gen 29. Actualmente dada la estrecha relación a nivel genómico entre los diferentes virus herpéticos se ha diseñado una RCP múltiple (Kit RADAR®), consiguiéndose de esta manera que en una sola amplificación se pueda detectar cualquier virus en muestras con escasa concentración de partículas.
5.3.3. Ventajas e inconvenientes
La RCP presenta ventajas frente a otras técnicas de diagnóstico intraocular:
• Frente a la biopsia coriorretiniana: muchísima menor morbilidad. Además la RCP se puede aplicar sobre material en parafina de antiguas o recientes biopsias (26), logrando la confirmación biológica de la impresión diagnóstica histológica previa.
• Frente al cultivo: rapidez. Los resultados se pueden obtener en un día, mientras la mayoría de los cultivos van a tardar semanas en crecer y positivizarse. Además es más sensible, al poderse ampliar el material genético partiendo desde una única célula inicial.
• Frente a la serología intraocular (27-31): más sensible, pues el índice de Goldmann-Witmer-Desmonts es positivo en muy pocos pacientes con SIDA. Así por ejemplo, es posible y frecuente encontrar en una misma muestra de humor acuoso test de RCP positivo e índice de Goldmann-Witmer-Desmonts negativo. Personalmente hemos podido observar un paciente con uveítis anterior sin foco retinocoroideo y refractaria a tratamiento antiinflamatorio, RCP positiva e índice de Witmer negativo, curando tras la instauración del tratamiento antitoxoplásmico
En términos generales, la sensibilidad de la RCP varía del 50-80% dependiendo de:
1.- El tipo de muestra, pues existen muchos casos donde el test resultará positivo sólo en uno de los dos compartimentos: vítreo o humor acuoso.
También son posibles incongruencias entre el resultado de las dos muestras (acuoso y vítreo), o del cuadro clínico oftalmoscópico y el germen identificado por RCP. Mitchell y Fox (31) comunicaron dos casos clínicos de retinitis CMV típica en los que la RCP en humor acuoso resultó positiva para Zóster y negativa para CMV; pero en vítreo las positividades eran inversas. En términos generales, y ésta es además nuestra experiencia, en casos de incongruencia tiene mayor valor diagnóstico en las uveítis posteriores la determinación positiva en vítreo que en acuoso. Hemos podido observar en dos casos típicos de Síndrome de Necrosis Retiniana Aguda RCP positiva en vítreo para Zóster y CMV (coinfección), siendo positiva sólo frente a CMV en humor acuoso. En un tercer caso oftalmoscópicamente típico encontramos RCP negativa para Zóster y positiva para CMV (tabla 2).
2.- El momento de la toma de muestra. Si la infección es reciente -primeras dos semanas desde el inicio clínico de la uveítis- la posibilidad de ser positiva es mayor, a diferencia de lo que ocurre con el índice de Witmer que no se positivizará hasta la resolución del cuadro. Si el paciente ya ha recibido tratamiento el porcentaje de positividad disminuye, aunque en algunos pacientes puede seguir siendo detectable (29).
Si nos limitamos al CMV, Zóster y Toxoplasma (no en Herpes Simple, Epstein-Barr, etc. donde no resulta fiable) también la RCP es más específica que el índice de Witmer, con una especificidad cercana al 100% (nunca inferior al 90%), sin prácticamente posibilidad de reacciones cruzadas de positividad entre diferentes gérmenes; a menos que exista contaminación por no haberse manipulado escrupulosamente la muestra (falsos positivos).
En resumen, la combinación del índice Goldmann-Witmer-Desmonts con las técnicas de RPC en humor acuoso y vítreo, en el diagnóstico de las retinitis toxoplásmica, por CMV y necrosis retiniana (zóster) en pacientes con SIDA, aumenta la sensibilidad diagnóstica que cada una presenta aisladamente. De ambas la RCP tiene una mayor rentabilidad diagnóstica, sobre todo en las fase precoces de la infección ocular, siendo el índice de Witmer más sensible en fases tardías (3-4 semanas, para que se puedan sintetizar los anticuerpos) y tras la instauración del tratamiento antiinfeccioso.
Además de los porcentajes de falsos positivos (muy pequeño) y falsos negativos (todavía grande), la RCP presenta actualmente una limitaciones y cuestiones sin resolver:
1. Hospitales de referencia. En la actualidad la RCP es todavía una técnica de investigación que requiere personal especializado en técnicas de Biología Molecular, realizándose en nuestro país sólo en algunos hospitales de tercer nivel. Cuando se realiza con sondas radioactivas es necesario que el laboratorio tenga además instalaciones homologadas.
2. Ausencia de test de referencia o grupo control. Uno de los problemas principales a la hora de evaluar la sensibilidad y especificidad de ésta técnica es la falta de control de certeza (cultivo, histopatología) para el diagnóstico obtenido en todos los estudios hasta ahora realizados.
3. Cuantificación de la infección. Hasta ahora el test determina únicamente presencia o no del germen. Si es positivo no establece su capacidad de replicarse y producir infección. La llegada de «kits con RCP Cuantificable» conferirá mayor valor diagnóstico y terapéutico a esta técnica.
4. No estandarizado: los «kits» comerciales determinan para un mismo germen diferentes regiones genéticas, pudiendo influir esto en la diferente sensibilidad encontrada para un mismo germen en diferentes estudios.
5. Volumen de muestra. Principalmente en muestras de humor acuoso no será posible determinar más de 2 ó 3 agentes, lo que nos obligará a seleccionar previamente por la clínica los agentes etiológicos más probables.
Podemos concluir que a pesar de sus limitaciones no existe actualmente método más incruento, sensible y específico en el diagnóstico de certeza de las uveítis infecciosas en pacientes con SIDA que la RCP en humor acuoso o vítreo (32).
BIBLIOGRAFÍA