López García JS, Rivas L, García Lozano I

Objetivos: Determinar la importancia del estado funcional del limbo como factor pronóstico después de queratoplastias mediante citología de impresión y biopsia limbal.

Métodos: Hemos estudiado 12 ojos de pacientes con insuficiencia limbal que precisaron de una queratoplastia. El primer grupo estuvo integrado por 5 ojos (3 ojos con quemaduras oculares y 2 con aniridia) que no recibieron ningún tratamiento quirúrgico previo de su insuficiencia limbal. El segundo grupo estuvo formado por 7 ojos: 1 ojo con síndrome de Stevens-Johnson (SSJ), 1 ojo con penfigoide ocular cicatricial (POC), 1 ojo con aniridia y 3 ojos con quemaduras oculares, que previamente fueron tratados mediante trasplante de membrana amniótica (TMA) o trasplante de limbo (TL) recubierto con membrana amniótica (TL + TMA) según el grado de disfunción limbal. Mediante citología corneal y biopsia limbal hemos estudiado la morfología del epitelio limbocorneal y de su estroma. La citología se realizó antes de la queratoplastia y a los 3 y 9 meses después de ésta. La biopsia limbal se realizó antes del trasplante corneal y 9 meses después.

Resultados: En la citología realizada a los 9 meses, las células del epitelio corneal en el primer grupo de pacientes presentaron un tamaño celular medio de 1.944,5±168,4 µm², un tamaño nuclear de 85,4±9,3 µm² y una relación núcleo-citoplasma (N:C) superior a 1:20. En estos pacientes la presencia de conjuntivalización del epitelio corneal, definida por la presencia de células caliciformes, fue del 60%. En el segundo grupo, las células presentaron un tamaño celular medio de 876,1±39,2 µm², un tamaño nuclear de 90,7±9,5 µm² y una relación núcleo-citoplasma (N:C) inferior a 1:10. Sólo uno de estos pacientes presentó conjuntivalización del epitelio corneal. La biopsia limbocorneal evidenció una mejor regeneración epitelial en el grupo de pacientes tratados previamente de la insuficiencia limbal.

Conclusiones: El tratamiento del la insuficiencia limbal previo a la queratoplastia mejora el pronóstico funcional y visual en pacientes con déficit limbal.

Palabras claves: Deficiencia limbal, citología de impresión, biopsia limbal, trasplante limbal, membrana amniótica.

Purpose: To determine the importance of limbal functionality as prognostic factor after keratoplasty by impression cytology and limbal biopsy.

Methods: We studied 12 eyes of patients with limbal deficiency treated by keratoplasty. The first group included 5 eyes (3 eyes with ocular burns and 2 eyes with aniridia) without surgical treatment previous for limbal deficiency. The second group included 7 eyes: 1 eye with Stevens-Johnson syndrome (SSJ), 1 eye with ocular cicatricial pemphigoid (OCP), 1 eye with aniridia and 3 eyes with ocular burns, that previously was treated by amniotic membrane transplantation (AMT) or limbal transplantation combined with amniotic membrane transplantation (LT + AMT) about the limbal deficiency severity. We studied the stroma and limbocorneal epithelium by impression cytology and biopsy. Impression cytology was performed before keratoplasty and 3 and 9 months later. Limbal biopsy was made before keratoplasty and 9 months later.

Results: Nine months after keratoplasty, the first group showed a cellular size of 1,944.5±168.4 µm², a nuclear size of 85.4±9.3 µm² and a nuclear-cytoplasmic (N:C) ratio higher to 1:20. In these patients corneal conjuntivalization was higher to 60%. In the second group, the cellular size was 876.1±39.2 µm², nuclear size was 90.7±9.5 µm² and N:C ratio was lower than 1:10. Only one patient showed corneal conjuntivalization. Limbal biopsy showed a better epithelial regeneration in patients that previously was treated by limbal deficiency.

Conclusions: Limbal deficiency treatment previous to keratoplasty improves the visual and functional prognosis in patients with limbal deficiency.

Key words: Limbal deficiency, impression cytology, limbal biopsy, limbal transplantation, amniotic membrane.

La regeneración del epitelio corneal depende, en parte, del grado de funcionalidad del limbo esclerocorneal ya que a este nivel se localizan las células madre progenitoras del epitelio corneal (1). El déficit funcional de estas células produce un cuadro que clínicamente se caracteriza por una vascularización del epitelio corneal, inflamación crónica, defectos epiteliales persistentes y recurrentes, fotofobia y pérdida de visión que pueden ser más o menos graves dependiendo del número de células madre afectadas (2). La insuficiencia limbal se produce generalmente por agresiones externas y con menor frecuencia se asocia a enfermedades congénitas como la aniridia o presenta un carácter idiopático (3-5).

La disminución de la visión en estos pacientes se suele deber a la pérdida de la transparencia corneal. Ésta suele producirse como secuelas de las úlceras y erosiones recidivantes del epitelio corneal o bien ser consecuencia directa de la agresión que ocasionó la deficiencia limbal como ocurre en el caso de las quemaduras oculares (6). La recuperación visual de estos pacientes pasa necesariamente por la realización de una queratoplastia penetrante o lamelar (7), que puede realizarse como procedimiento único o asociada a otros procedimientos como el trasplante de limbo (8,9).

La citología de impresión nos permite estudiar de forma fácil y no invasiva las capas celulares más superficiales del epitelio corneal, permitiéndonos el diagnóstico y seguimiento de un importante número de patologías de la superficie ocular (10,11). La biopsia limbocorneal nos informa del estado de todas las capas del epitelio así como de la organización del estroma (12).

En el presente trabajo pretendemos estudiar el comportamiento del epitelio corneal mediante citología de impresión y biopsia limbocorneal después de queratoplastias en pacientes con insuficiencia limbal según la gravedad de ésta y de que fuesen o no previamente tratados del déficit limbal.

En la selección de pacientes, técnicas aplicadas y manejo de las muestras se cumplieron las normas internacionales y nacionales para estudios clínicos. A todos los pacientes que, de forma voluntaria, quisieron intervenir en este estudio se les solicitó por escrito la aceptación de su participación.

Hemos realizado un estudio retrospectivo en 12 ojos de pacientes con insuficiencia limbal que precisaron de una queratoplastia. Todos los pacientes presentaron clínica de insuficiencia limbal caracterizada por fotofobia, disminución de visión, inflamación crónica de la superficie ocular, lagrimeo, defectos epiteliales persistentes, úlceras recurrentes, opacificación corneal y neovascularización corneal. El primer grupo estuvo integrado por 5 ojos (3 ojos con quemaduras oculares y 2 con aniridia) que no recibieron ningún tratamiento quirúrgico de su insuficiencia limbal previo a la queratoplastia. De estos, 3 ojos (1 ojo con aniridia y 2 ojos con quemadura ocular) presentaron clínica de insuficiencia limbal moderada, mientras que 2 ojos (1 ojo con quemadura ocular y otro con aniridia) presentaron clínica de insuficiencia limbal grave. El segundo grupo estuvo formado por 7 ojos [1 ojo con síndrome de Stevens-Johnson (SSJ), 1 ojo con penfigoide ocular cicatricial (POC), 1 ojo con aniridia y 4 ojos con quemaduras oculares]. De éstos, 4 ojos (1 ojo con SSJ, 1 ojo con aniridia y 2 ojos con quemaduras oculares) presentaron clínica de insuficiencia limbal moderada y previamente fueron tratados mediante trasplante de membrana amniótica (TMA), mientras que 3 ojos (1 ojo con POC y dos ojos con quemaduras oculares) presentaron clínica de insuficiencia limbal grave y fueron tratados previamente a la queratoplastia mediante un trasplante de limbo (TL) recubierto con membrana amniótica (TL + TMA).

El seguimiento post-quirúrgico fue de 9 meses tras la realización de la queratoplastia. La edad media en el momento de la operación fue de 43±14 años (comprendidos entre los 24 y 73 años). La evaluación de la superficie corneal después de la cirugía se realizó mediante citología de impresión del epitelio corneal y mediante biopsia limbocorneal. La citología se realizó antes de la queratoplastia y a los 3 y 9 meses después de ésta. La biopsia limbal se realizó antes del trasplante corneal y 9 meses después.

Para la citología de impresión, las muestras obtenidas de los cuatro cuadrantes corneales fueron recogidas sobre tiras de papel millipore HAWP304 de 5x5 mm de tamaño, fijadas en etanol al 96% y teñidas con PAS-hematoxilina de acuerdo con el protocolo de Locquin y Langeron modificado por Rivas et al (13), observándose posteriormente al microscopio óptico. El criterio utilizado para el diagnóstico en la citología corneal se basó en la forma y tamaño de las células, la separación entre ellas, su tamaño nuclear, la tinción del citoplasma, las alteraciones nucleares, la relación núcleo-citoplasma y la presencia de conjuntivalización corneal. Para valorar el grado de afectación, las células corneales fueron graduadas en una escala que iba de 0 a 5 grados, según la clasificación de la metaplasia escamosa propuesta por Murube y Rivas (14). Estos autores distinguen cinco grados de alteración celular y un grado 0 que recoge las características normales de las células.

La biopsia se realizó previa anestesia tópica de la superficie ocular con anestésico doble (Colircusí anestésico doble^®, Alcon Cusí, S.A. Barcelona) instilada en el fondo de saco conjuntival. El tamaño de la muestra limbal fue aproximadamente de 2 mm², y el procesamiento de ésta siguió el protocolo habitual del laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Ramón y Cajal, excepto en la fijación, en la que para poder estabilizar la capa de mucina de la película lagrimal ésta se realizó en glutaraldehido al 1,5% con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) y en tampón fosfato; posteriormente se realizó una segunda fijación en glutaraldehido al 1% con ácido tánico al 1% en el mismo tampón y, por último, una tercera fijación en tetraóxido de osmio al 1% en tampón Palade. Las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de acetona (30, 50, 70, 90 y 100%) y óxido de propileno. El medio de contraste consistió en una solución de acetato de uranilo al 2% añadido a la acetona al 70%, proporcionando un mayor contraste a las membranas del tejido. La inclusión se realizó en Araldita (Durcupan-Ciba). Las muestras se endurecieron incluidas en cápsulas de gelatina y se recubrieron con Araldita. El seccionamiento de las muestras se realizó en un ultramicrotomo modelo Reichert-Jung, Ultracut E. Los cortes histológicos para el estudio en microscopio óptico se obtuvieron de un grosor aproximado de 2 micras y se tiñeron con azul de Richardson.

La agudeza visual (AV) media en el primer grupo previa a la queratoplastia fue de 0,08 (0,01-0,15), mientras que en el segundo grupo fue de 0,05 (0,01-0,1). Después de nueve meses, la AV en el primer grupo fue de 0,36 (0,2-0,6), mientras que en el segundo grupo fue de 0,6 (0,4-0,8). En ambos grupos la mejoría en cuanto a AV fue significativa después de la queratoplastia, asimismo fue significativa la mejoría de la AV en el grupo de pacientes tratados previamente del déficit limbal en relación al grupo de pacientes no tratados. De igual forma, los pacientes pertenecientes al segundo grupo refirieron menos molestias subjetivas durante el postoperatorio. En dos casos del primer grupo fue necesaria otra queratoplastia posterior para reestablecer la función visual.

En la citología corneal realizada previa a la queratoplastia en el grupo de pacientes que no fueron tratados de la insuficiencia limbal encontramos que los pacientes con insuficiencia limbal moderada presentaron un tamaño celular medio de 1.568±159 µm², un tamaño nuclear de 86,3±15 µm² y una relación núcleo-citoplasma (N:C) de 1:18. Los pacientes de este mismo grupo con insuficiencia limbal grave presentaron un tamaño celular de 2.250±310 µm², un tamaño nuclear de 82,4 ±14,8 µm² y una relación N:C superior a 1:25. Las células presentaron abundantes espacios intercelulares en la citología. La tinción del citoplasma fue eosinófila o metacromática, siendo común la presencia de alteraciones nucleares como células anucleadas o binucleadas y núcleos picnóticos. En estos pacientes la presencia de células caliciformes fue la norma (fig. 1). En el grupo de pacientes que fueron previamente tratados mediante TMA o TL + TMA no hicimos distinción en cuanto a la gravedad de la insuficiencia limbal previa al tratamiento de ésta. Las células del epitelio corneal presentaron un tamaño celular medio de 806,7±37,9 µm², un tamaño nuclear de 91,4±10,5 µm² y una relación núcleo-citoplasma (N:C) inferior a 1:8. Las células estaban bastante compactadas. La tinción del citoplasma fue eosinófila y encontramos pocas alteraciones nucleares. Ningún paciente de este grupo presentó conjuntivalización del epitelio corneal (fig. 2).

Fig. 1. Citología de un paciente con insuficiencia limbal moderada previa a la queratoplastia. Se aprecia un aumento considerable del tamaño celular, así como presencia de células caliciformes. Tinción PAS-hematoxilina.

Fig. 2. Citología de un paciente con insuficiencia limbal moderada tratada con TMA previa a la queratoplastia. Las células epiteliales presentan un tamaño ligeramente superior al normal. Tinción PAS-hematoxilina.

En la citología realizada a los 3 meses de la queratoplastia, las células del epitelio corneal en el primer grupo de pacientes presentó un tamaño celular medio de 1.823±211 µm², un tamaño nuclear de 84,2±14,8 µm², y una relación N:C superior a 1:20. La mitad de estos pacientes presentó conjuntivalización del epitelio corneal. En el segundo grupo, el tamaño celular fue de 848±9,1 µm², el tamaño nuclear de 92,4±8,8 µm² y la relación N:C fue de 1:9. Ningún paciente de este grupo presentó conjuntivalización.

En la citología realizada a los 9 meses, las células del epitelio corneal en el primer grupo de pacientes presentaron un tamaño celular medio de 1.944,5±168,4 µm², un tamaño nuclear de 85,4±9,3 µm² y una relación N:C superior a 1:20. En estos pacientes la presencia de conjuntivalización del epitelio corneal, definida por la presencia de células caliciformes, fue del 60% (fig. 3). En el segundo grupo, las células presentaron un tamaño celular medio de 876,1±39,2 µm², un tamaño nuclear de 90,7±9,5 µm² y una relación núcleo-citoplasma (N:C) inferior a 1:10. Sólo uno de estos pacientes presentó conjuntivalización del epitelio corneal. No hubo diferencias en ninguno de los dos grupos en cuanto a la tinción del citoplasma y presencia de alteraciones nucleares con respecto a la primera citología.

Fig. 3. Citología realizada a los nueve meses de la queratoplastia en un paciente con insuficiencia limbal grave no tratado previamente. Se aprecia un importante aumento de los espacios intercelulares así como la presencia de células caliciformes. Tinción PAS-Hematoxilina.

En la biopsia realizada previa a la queratoplastia, los pacientes del primer grupo presentaron unas células epiteliales con un citoplasma grande. Los núcleos presentaron aspecto alargado con importante número de alteraciones nucleares. Se observaron células caliciformes generalmente muy alteradas (fig. 4). En todos los pacientes la capa de mucina fue muy delgada y discontinua, y muchas veces ausentes. La membrana basal presentó un aspecto muy delgado y discontinuo respecto a los controles. El estroma fue denso, con un considerable número de células inflamatorias. En el segundo grupo, las células epiteliales mostraron un tamaño algo mayor y una distribución muy similar a la normal en todas sus capas (fig. 5). La capa mucínica fue prácticamente normal. El estroma fue bastante laxo, la cantidad y organización de las fibras de colágeno fue similar a la normalidad. La presencia de células inflamatorias fue muy escasa. Los vasos linfáticos y sanguíneos fueron casi normales.

Fig. 4. Biopsia limbal previa a la queratoplastia de un paciente con insuficiencia limbal moderada no tratada previamente. Se aprecia un adelgazamiento de la capa de mucina y la presencia de células caliciformes. Tinción azul de Richardson.

Fig. 5. Biopsia limbal previa a la queratoplastia en un paciente con insuficiencia limbal grave tratada con TL+TMA. Se aprecia como la distribución y tamaño de las células epiteliales es muy parecido a la normalidad. Tinción azul de Richardson.

En la biopsia realizada a los nueve meses encontramos un ligero empeoramiento en el primer grupo de pacientes, sobre todo en aquellos con insuficiencia limbal grave, por el contrario la biopsia limbocorneal en los pacientes que fueron previamente tratados con TMA o TL + TMA presentaba un aspecto muy similar al encontrado previamente a la queratoplastia.

Las diversas etiologías de los procesos tratados en este trabajo nos obliga a ser prudentes a la hora de generalizar los resultados obtenidos. Aunque todos los procesos se caracterizan por presentar en mayor o menor medida una insuficiencia limbal, son procesos de diversa etiopatogenia en los que no podemos generalizar un mismo comportamiento en la recuperación del epitelio limbocorneal (15-17). De igual forma, tampoco cabe esperar un comportamiento similar en cuanto al grado de tolerancia del injerto corneal tras la queratoplastia en las distintas etiologías que pueden cursar con insuficiencia limbal. Así por ejemplo en casos de quemaduras oculares, la queratoplastia presenta un mayor porcentaje de éxito si se realiza en fases de rehabilitación tardía cuando ya ha disminuido la respuesta inflamatoria (7). Por otro lado, el pronóstico es peor en casos en los que existen trastornos conjuntivales y palpebrales como es el caso de pacientes con SSJ, POC o pacientes con quemaduras, o en presencia de vascularización en los que se requiere de una mayor terapia inmunosupresora (8).

En este trabajo no hemos pretendido estudiar los mecanismos de rechazo del injerto corneal. Únicamente hemos pretendido determinar la importancia la correcta epitelización de la superficie ocular en el pronóstico funcional de las queratoplastias. Aunque es conocido que en la mayoría de los casos el rechazo del injerto se inicia a nivel endotelial (18), pensamos que debido a la interdependencia existente entre las distintas estructuras de la superficie ocular su correcta integración es fundamental para mantener la integridad y transparencia corneal (19).

Los resultados obtenidos mediante citología de impresión y biopsia limbal nos muestran cómo el grado de metaplasia del epitelio corneal tras queratoplastias es menos patológico en el grupo de pacientes que han sido previamente tratados mediante TMA o TL + TMA de su insuficiencia limbal. En el primer caso, los pacientes con insuficiencia limbal grave mostraron tras nueve meses de seguimiento una metaplasia escamosa grado 4-5 según la clasificación de Murube y Rivas (2003) (14) con más un 100% de conjuntivalización del epitelio corneal y frecuente vascularización superficial. La AV en estos pacientes fue significativamente menor que en el otro grupo de pacientes precisándose en dos casos la realización de una nueva queratoplastia frente a ninguna en el grupo de pacientes que fueron previamente tratados de su déficit limbal. Los pacientes de este grupo con insuficiencia limbal moderada presentaron un grado de metaplasia escamosa grado 3-4 y conjuntivalización en un 40% de los casos. En el segundo grupo encontramos, después de nueve meses de la queratoplastia, una metaplasia escamosa grado 2 con un solo paciente que presentase conjuntivalización del epitelio corneal y no precisando ningún paciente de este grupo la realización de una queratoplastia posteriormente para garantizar la transparencia corneal.

De acuerdo con las consideraciones patológicas de la deficiencia de células madre del limbo, la queratoplastia convencional en estos pacientes fracasará invariablemente con el tiempo debido a un proceso de conjuntivalización y vascularización así como a las graves alteraciones de la superficie ocular que frecuentemente asocian. Parece lógico, por tanto, preparar la superficie ocular de forma previa a la realización de una queratoplastia. En este sentido, la reconstrucción conjuntival con membrana amniótica ha dado buenos resultados en el manejo de pacientes con POC y SSJ (20,21), así como la reconstrucción palpebral (22). Del mismo modo, parece obligado en estos pacientes mejorar el grado de suficiencia limbal previo a la queratoplastia. Por tanto el trasplante de tejido limbal es aconsejable para mejorar la supervivencia y transparencia de un injerto corneal tras queratoplastia. Aunque algunos autores realizan en el mismo acto quirúrgico ambos procedimientos (8,23), nosotros preferimos estabilizar en primer lugar el epitelio corneal mediante la realización de TL + TMA o sólo TMA, según la gravedad de la insuficiencia limbal, y posteriormente realizar la queratoplastia. El procedimiento combinado queratoplastia más TL sólo lo hemos empleado en algún caso de pacientes con aniridia. En pacientes con quemaduras oculares, SSJ o POC la opacidad corneal es un componente más dentro del complejo cuadro clínico que presentan estos pacientes y pensamos que en ellos el tratamiento de la opacidad corneal no debe abordarse hasta que no se haya normalizado la superficie ocular.

Podemos concluir diciendo que el establecimiento de una adecuada funcionalidad del limbo esclerocorneal es fundamental para la supervivencia y funcionalidad del injerto corneal tras queratoplastias en pacientes con deficiencia limbal.

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