López García JS, Rivas L, García Lozano I

Objetivos: Determinar si existe relación entre el grado de metaplasia escamosa de la superficie corneal mediante citología de impresión y la gravedad clínica en pacientes con insuficiencia limbal.

Métodos: Hemos estudiado mediante citología de impresión 68 ojos de pacientes con insuficiencia limbal. Se establecieron tres grados de insuficiencia limbal: leve, moderada y grave. 28 ojos presentaron un grado leve de insuficiencia limbal, 22 ojos un grado moderado y 18 ojos una insuficiencia limbal severa. La citología corneal se realizó previa al tratamiento. Se estudió el tamaño celular, tamaño nuclear, alteraciones nucleares y relación núcleo-citoplasma (N:C), así como la presencia de células caliciformes.

Resultados: Los pacientes con insuficiencia limbal leve presentaron un tamaño celular medio de 794,1±35,6 µm², un tamaño nuclear de 91,4±8,8 µm² y una relación núcleo-citoplasma (N:C) de 1:8. Ninguno de estos pacientes presentó conjuntivalización del epitelio corneal. Los pacientes con insuficiencia limbal moderada presentaron un tamaño celular medio de 1874,5±155,6 µm², un tamaño nuclear de 86,4±8,7 µm² y una relación N:C de 1:22. Estos pacientes presentaron con cierta frecuencia conjuntivalización del epitelio corneal, definida por la presencia de células caliciformes. Los pacientes con insuficiencia limbal grave presentaron un tamaño celular medio de 2.523,6±320,5 µm², con un tamaño nuclear de 82,4±9,8 µm² y una relación N:C próxima a 1:30. La presencia de conjuntivalización en la citología corneal fue la norma en todos los casos.

Conclusiones: Existe una correlación entre la gravedad de la deficiencia limbal y el grado de metaplasia escamosa en la citología de impresión. La citología de impresión es particularmente útil para el diagnóstico en los casos de déficit limbal leve o subclínico.

Palabras claves: Aniridia, deficiencia limbal, citología de impresión.

Purpose: To determine the correlation between squamous metaplasia grade of corneal surface and clinic severity in patients with limbal deficiency.

Methods: We studied 68 eyes of patients with limbal deficiency by impression cytology. We defined three grades of limbal deficiency: mild, moderate and severe. Twenty eight eyes showed a light grade of limbal deficiency, 22 eyes a moderate grade and 18 eyes a severe limbal deficiency. Corneal cytology was obtained before treatment. Cellular size, nuclear size, nuclear changes and nuclear-cytoplasm (N:C) ratio were examined in corneal epithelial cells, besides goblet cells presence in corneal epithelium.

Results: In patients with mild limbal deficiency we found that cellular size was 794,1±35,6 µm^2, nuclear size was 91.4±8.8 µm² and N:C ratio was 1:8. These patients do not showed corneal conjunctivalization. In patients with moderate limbal deficiency the cellular size was 1,874.5±155.6 µm², nuclear size was 86.4±8.7 µm² and N:C ratio was 1:8. Some patients showed corneal conjunctivalization that was defined by goblet cell presence in corneal epithelium. In patients with severe limbal deficiency, cellular size was 2,523.6±320.5 µm², nuclear size was 82.4±9.8 µm² and N:C ratio was near to 1:30. The corneal conjunctivalization was present in all patients.

Conclusions: There is a correlation between limbal deficiency severity and squamous metaplasia grade study by impression cytology. The impression cytology is very useful for diagnosis in cases of light or subclinic limbal deficiency.

Key words: Aniridia, limbal deficiency, impression cytology, ocular surface.

La insuficiencia límbica es una entidad clínica que se produce por destrucción de las células madre limbares. Esta destrucción suele obedecer generalmente a agresiones externas y con menor frecuencia se asocia a enfermedades congénitas como la aniridia o presenta un carácter idiopático (1-3). Clínicamente se caracteriza por una vascularización del epitelio corneal, inflamación crónica, inestabilidad de la película lagrimal, defectos epiteliales persistentes y recurrentes, fotofobia y pérdida de visión. La insuficiencia límbica puede presentar una gravedad variable dependiendo del número de células madre afectadas.

La citología de impresión nos permite estudiar las capas celulares más superficiales del epitelio córneal y conjuntival, que son recogidas mediante la aplicación de papeles de filtro. Como herramienta de diagnóstico, la citología suple cada vez más frecuentemente a la biopsia. Se trata de una técnica mínimamente invasiva, de fácil realización y que puede ser repetida a lo largo del tiempo, permitiendo el diagnóstico y seguimiento de una larga lista de alteraciones de la superficie ocular (4-6). Aunque la aplicación más común de la citología de impresión es valorar el grado de metaplasia escamosa conjuntival en pacientes con clínica de ojo seco (7), también se ha utilizado para estudiar la superficie ocular después de intervenciones como trasplante de limbo y trasplante de membrana amniótica (8,9). Existen diversos sistemas de graduación de la metaplasia escamosa (10,11). Estos sistemas se basan en la disminución de la densidad de células caliciformes, el aumento del tamaño de las células no secretoras, el incremento de la estratificación celular, los cambios metacromáticos en la tinción citoplasmática, la separación celular, los cambios morfológicos del núcleo, el incremento de la relación N:C y la aparición de queratinización.

En el presente trabajo pretendemos establecer si existe una correlación entre el grado de metaplasia escamosa del epitelio corneal y el grado de severidad de la insuficiencia limbal, con el fin de determinar el valor diagnóstico de la citología de impresión en pacientes con disfunción limbal.

En la selección de pacientes, técnicas aplicadas y manejo de las muestras se cumplieron las normas internacionales y nacionales para el estudio clínico. A todos los pacientes que, de forma voluntaria, quisieron intervenir en este estudio se les solicitó por escrito la aceptación de su participación.

Hemos realizado un estudio prospectivo sobre 68 ojos de 44 pacientes (28 hombres y 16 mujeres) con insuficiencia limbal causada por quemaduras oculares (24 ojos), aniridia (22 ojos), síndrome de Stevens-Johnson (10), penfigoide ocular cicatricial (6), portadores de lentes de contacto (4), postcirugía de pterigion (4). Mediante anamnesis y valoración clínica se establecieron tres grupos según la insuficiencia limbal fuera leve, moderada o grave. Se consideró que un paciente presentaba clínica de insuficiencia limbal leve cuando el paciente refería un máximo de dos episodios de úlceras recurrentes o erosiones recidivantes en los últimos 6 meses y leve fotofobia. A la exploración con lámpara de hendidura, estos pacientes no presentaban alteraciones significativas, salvo que coincidiese con algún periodo de actividad. En este grupo se incluyeron 28 ojos. Se consideró que un paciente presentaba clínica de insuficiencia limbal moderada cuando el número de episodios de erosiones recidivantes o úlceras recurrentes fue igual o superior a 3 episodios en los últimos 6 meses y en la exploración con lámpara de hendidura se observaba una inestabilidad permanente de la película lagrimal y un pannus vascular periférico. En este grupo se incluyeron 22 ojos. Se consideró que un paciente presentaba clínica de insuficiencia limbal grave cuando en la exploración con lámpara de hendidura el paciente presentaba una vascularización corneal así como clínica de erosiones corneales e inestabilidad de la película lagrimal permanente. En este grupo se incluyeron 18 ojos.

Para el estudio mediante citología de impresión, las muestras obtenidas de los cuatro cuadrantes corneales fueron recogidas sobre tiras de papel Millipore HAWP304 de 5x5 mm de tamaño, fijadas con etanol al 96% durante 10 minutos y teñidas con PAS-hematoxilina de acuerdo con el protocolo de Locquin y Langeron modificado por Rivas et al. (12), observándose posteriormente con microscopio óptico.

Para el estudio morfométrico de estas células se trabajó a 40 aumentos sobre fotografías de 10x15 cm. Se empleó un equipo de análisis de imagen compuesto por un microscopio Nikon Ophtiphot-2 dotado de equipo fotográfico Microflex-DX y de una videocámara en color EVI-10011P acoplada a un monitor Sony Black Trinitron KT-14 CP1. El sistema está basado en el software IPP-Plus de Image Pro/Media Cibermetics y el sistema CAD.

El criterio utilizado para el diagnóstico en la citología corneal se basó en la forma y tamaño de las células, la separación entre ellas, su tamaño nuclear, la tinción del citoplasma, las alteraciones nucleares, la relación núcleo-citoplasma (N:C) y la conjuntivalización corneal. Para valorar el grado de alteración celular utilizamos la clasificación de metaplasia escamosa propuesta por Murube y Rivas (13). Las células corneales fueron graduadas en una escala que iba de 0 a 5 grados.

El análisis estadístico se realizó mediante el programa informático SPSS versión 11.0 para Windows. Las medidas utilizadas fueron la media y desviación estándar. Las pruebas estadísticas aplicadas fueron el estudio de la varianza y la prueba de la t de Student. Se consideraron resultados estadísticamente significativos todos aquellos que mostraron una probabilidad superior al 95% (p>0,05).

En el grupo de pacientes con insuficiencia limbal leve, las células del epitelio corneal presentaron un tamaño celular medio de 794,1±35,6 µm², con pocos espacios intercelulares entre ellas. La tinción del citoplasma fue en todos los casos eosinófila. El tamaño nuclear fue de 91,4±8,8 µm². Sólo en un 30% de los casos encontramos alteraciones nucleares, siendo la más común la presencia de células binucleadas. La relación N:C fue de entorno a 1:8. En ninguno de estos pacientes encontramos presencia de células caliciformes en la citología corneal (fig. 1).

Fig. 1. Citología corneal de un paciente con insuficiencia limbal leve. Se aprecia un aumento del tamaño celular con aumento del espacio intercelular. La tinción del citoplasma es eosinófila y, salvo una célula binucleada, apenas existen alteraciones nucleares. Tinción PAS-hematoxilina.

En el grupo de pacientes con insuficiencia limbal moderada, las células del epitelio corneal presentaron un tamaño celular medio de 1.874,5±155,6 µm² con un aumento importante de los espacios intercelulares. La tinción predominante del citoplasma fue eosinófila pero en algunos casos esta presentó un aspecto metacromático. El tamaño nuclear fue de 86,4±8,7 µm². Encontramos alteraciones nucleares en más de un 50% de los casos, siendo las más comunes la presencia de células binucleadas, células con núcleos picnóticos y células enucleadas. La realación N:C fue de entorno a 1:22. En este grupo de pacientes encontramos en un 35% de los casos conjuntivalización corneal que vino definida por la presencia, aunque en escaso número, de células caliciformes en la citología corneal. Estas células caliciformes presentaron un tamaño ligeramente inferior al observado en la conjuntiva normal de ojos controles y con pobre contenido mucínico (fig. 2).

Fig. 2. Citología corneal de un paciente con insuficiencia límbica moderada. Destaca la abundante presencia de células binucleadas y núcleos picnóticos, así como la presencia de una célula caliciforme. Tinción PAS-hematoxilina.

En el grupo de pacientes con insuficiencia limbal grave encontramos unas células epiteliales con un tamaño medio de 2.523,6±320,5 µm² con enormes espacios intercelulares entre ellas e incluso signos de queratinización. La tinción del citoplasma fue en casi todos los casos metacromática e incluso basófila. El tamaño nuclear fue de 82,4±9,8 µm². La presencia de alteraciones nucleares fue la norma encontrándolas en más del 90% de los pacientes. La alteración nuclear más común fue con mucho la presencia de células anucleadas, seguida por la presencia de células binucleadas y núcleos picnóticos. La relación N:C estuvo muy alterada superando incluso el índice de 1:30 (figs. 3 y 4). La presencia de abundantes células caliciformes en la citología corneal fue la norma en la totalidad de los pacientes. Éstas presentaron un tamaño inferior al observado en conjuntiva normal de ojos controles y generalmente con muy poco contenido mucínico (fig. 5).

Fig. 3. Citología corneal de un paciente con insuficiencia limbal grave. Destaca la presencia de citoplasma metacromático o basófilo así como la presencia de queratinización y abundantes células sin núcleo. Tinción PAS-hematoxilina.

Fig. 4. Alteraciones nucleares en un paciente con insuficiencia limbal grave. Se aprecia una célula sin núcleo mientras que la otra célula presenta tres núcleos. Tinción PAS-hematoxilina.

Fig. 5. A gran aumento detalle de una célula caliciforme en la citología corneal de un paciente con insuficiencia limbal grave. Tinción PAS-hematoxilina.

La citología de impresión respeta la morfología de la superficie ocular y mantiene la disposición bidimensional de las células en el epitelio corneal sin alterar la morfología de éstas. Mediante citología se puede realizar un diagnóstico diferencial entre distintas enfermedades que cursan con alteración de la película lagrimal o del epitelio de la superficie ocular (14,15). Este grado de metaplasia, nos informa del estado de la superficie ocular y, por tanto, de la severidad de la enfermedad.

En este trabajo hemos empleado la clasificación de la metaplasia escamosa propuesta por Murube y Rivas (2003) (13) para valorar la afectación de las células del epitelio corneal. De forma contraria a lo que ocurre con otros sistemas de graduación (8,9), la clasificación que hemos empleado incluye los cambios inducidos a nivel corneal, lo que consideramos de gran importancia para valorar el grado de disfunción del área limbal ya que, como es conocido, las alteraciones a nivel del limbo producen importantes trastornos a nivel de la superficie del epitelio corneal (16).

En este trabajo, hemos encontrado cómo existe una relación entre la severidad clínica de la afectación limbal y las alteraciones morfométricas de las células del epitelio corneal medidas mediante citología de impresión. Esta relación es particularmente llamativa en el caso del tamaño celular y de la relación N:C. Hemos encontrado como pacientes con clínica leve de insuficiencia limbal presentaban característica celulares que podrían englobarse en un grado 2-3 de metaplasia escamosa. Por el contrario los pacientes con insuficiencia limbal grave presentaban características celulares encuadradas en un grado 5 de metaplasia, presentando además un importante número de células caliciformes en la citología corneal que confirmaba citológicamente la presencia de conjuntivalización del epitelio corneal.

El diagnóstico clínico de insuficiencia limbal es relativamente fácil en casos moderados y graves de deficiencia limbal, sobre todo si existe un antecedente traumático. Sin embargo en los casos leves de déficit limbal el diagnóstico clínico puede pasar fácilmente desapercibido. En estos casos, la citología de impresión nos puede ser de gran ayuda ya que al tratarse de una prueba morfológica presenta una sensibilidad diagnóstica próxima al 100%.

La fluorofotometría se ha utilizado para detectar la deficiencia limbal incluso en estadios subclínicos (17). La citología de impresión también nos ayuda al diagnóstico en fases subclínicas al mostrarnos desde estadios muy tempranos un aumento en el grado de metaplasia escamosa. Esto lo hemos podido comprobar en pacientes con aniridia en donde hemos encontrado células epiteliales con metaplasia grado 2 y 3 sin que el paciente hubiese presentado ningún tipo de alteración clínica.

Podemos concluir que la citología de impresión es de gran utilidad en el diagnóstico de los estadios leves y subclínicos de insuficiencia limbal. De igual forma, nos sirve como prueba de referencia para valorar el efecto que sobre el epitelio corneal ejercen las distintas terapias empleadas en el manejo terapéutico de estos pacientes.

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