EFECTO DEL PRANOPROFENO TÓPICO EN LA LIPOOXIGENACIÓN DEL ÁCIDO ARAQUIDÓNICO EN LA UVEÍTIS INDUCIDA POR ENDOTOXINA

EFFECT OF TOPICAL PRANOPROFEN ON THE LIPOXYGENASE METABOLISM OF THE ARACHIDONIC AND IN ENDOTOXIN-INDUCED UVEITIS

TORRÓN C, FERRER E, RUIZ-MORENO O, CUEVAS R, PÉREZ S, ALABART JL, HONRUBIA FM

RESUMEN

Objetivo
Estudiamos el efecto del pranoprofeno sobre la lipooxigenación del ácido araquidónico en conejos albinos.
Métodos
La uveítis se produjo mediante la inyección intravítrea de 10 nanogramos de lipopolisacárido A de Salmonella typhimurium disueltos en 5 µl suero salino apirético. Se utilizaron 5 grupos de 12 animales a los que se les inyectó en el vítreo del ojo derecho: 5 µl de suero al grupo control y 5 µl de solución de endotoxina a los cuatro grupos restantes. Además a los grupos III, IV y V se les administró pranoprofeno tópico 2 horas antes de la inyección intravítrea, inmediatamente después y cada 6, 4 y 2 horas respectivamente. A las 24 horas se determinó en humor acuoso la concentración de células inflamatorias y de leucotrieno B4.
Resultados
En los tres grupos de tratamiento con pranoprofeno se observó una reducción estadísticamente significativa de la concentración de células inflamatorias respecto al grupo de endotoxina (G-II); no se observaron diferencias significativas en cuanto a la determinación del leucotrieno B4 con relación al grupo de endotoxina.
Conclusión
Concluimos que el pranoprofeno tópico no potencia la lipooxigenación del ácido araquidónico.
Palabras clave
Pranoprofeno, uveítis experimental, leucotrieno B4.

SUMMARY

Purpose
To study the antiinflammatory effect of topical pranoprofen on the lipoxygenase metabolism of the arachidonic acid in albino rabbits.
Methods
Endotoxin-induced uveitis (EIU) was produced in albino rabbits by intravitreal injection in the right eye with 10 µg of Salmonella typhymurium lipopolysacharide A in 5 µl saline solution. We have used 5 groups of 12 animals each. Control group (G-I) was injected with 5 µl of saline solution and 5 µl of ET solution were injected in the remaining groups. Groups III, IV and V were treated with topical pranoprofen 2 hours before intravitreal injection, immediately after and every 6, 4 and 2 hours respectively. The animals were sacrificed 24 hours after the ET administration. Cellular and B4 leukotrien concentration in the aqueous humour was determined.
Results
The groups treated with pranoprofen showed a significant decrease in the cellular concentration in relation to the group of endotoxin (G-II). We did not observe any difference in the B4 leukotriene concentration between ET group and topical pranoprofen groups.
Conclusion
Topical pranoprofen has not increased the lipoxygenase metabolism of the arachidonic acid.
Key words
Pranoprofen, experimental uveitis, leukotriene B4.

INTRODUCCIÓN

Cuando se produce una reacción inflamatoria en un tejido aparecen los mediadores celulares y químicos de la inflamación tanto a nivel local como a distancia (1). Uno de ellos es el ácido araquidónico y sus metabolitos (prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, lipoxinas, etc.) (2-5).

Todos los metabolitos formados a partir del ácido araquidónico intervienen en la aparición de los signos clínicos clásicos de la inflamación (hiperemia, rotura de la barrera hematoacuosa, infiltrado de células inflamatorias, variaciones de la presión intraocular, etc.) (6-13). La inflamación la podemos tratar fundamentalmente con dos tipos de fármacos: esteroides y no esteroides. Los antiinflamatorios esteroideos inhiben la síntesis de ácido araquidónico y por lo tanto de sus metabolitos (14,15). Los antiinflamatorios no esteroideos actúan a nivel de la ciclooxigenación del ácido araquidónico por tanto inhiben la formación de prostaglandinas y tromboxanos (16), sin embargo se cree que pueden potenciar la lipo-oxigenación del exceso de ácido araquidónico formado (17-19).

El pranoprofeno es un AINE derivado del ácido propiónico (2-5H-1benzopireno 2,3-b pyridin-7-y1). Está indicado para tratar las afecciones inflamatorias del segmento anterior del ojo. Como el resto de los AINES posee actividad antiiflamatoria, analgésica y antipirética. Se presenta en forma de colirio a una concentración de 1 mg/ml.

En nuestro trabajo pretendemos estudiar el efecto del Pranoprofeno sobre la vía de la lipo-oxigenación del ácido araquidónico en un modelo de uveítis inducida por endotoxina (UIE).

MATERIAL Y MÉTODOS

Animal de experimentación. Se han utilizado 60 conejos albinos (5 grupos de 12 animales) con peso de 1.600 a 1.900 gramos, sin tener en cuenta el sexo, siguiéndose las normas de la CEE para experimentación animal (CEE 86-609).

Drogas. Endotoxina (ET): hemos utilizado el LPS A de Salmonella Typhy (Sigma Co. Cell culture reagents), disuelto en suero salino a una concentración de 2 ng/µl, inyectándose un total de 10 ng en el vítreo del ojo derecho del animal de experimentación.

Terapéutica antiinflamatoria. Hemos utilizado el pranoprofeno por vía tópica a una concentración de 1 mg/ml.

Protocolo experimental. En el grupo I (grupo control) se ha inyectado en vítreo 5 µl de suero fisiológico. En el grupo II se ha inyectado en vítreo 5 µl de solución de endotoxina (10 ng de ET). A los grupos III, IV y V además de la administración de la ET, se les ha aplicado tópicamente pranoprofeno; 2 gotas (100 ul) 2 horas antes de la inyección intravítrea de ET, otras 2 inmediatamente después y cada 6 (G-III), 4 (G-IV) y 2 horas (G-V) respectivamente según el grupo.

A las 24 horas de la inyección de ET se ha extraído el humor acuoso previa anestesia (Clorhidrato de ketamina intramuscular -35mg/kg- y Xylacina -5 mg/kg-) bajo control microscópico utilizando agujas de 30 G desechables y jeringas heparinizadas de insulina; sacrificándose a continuación los animales mediante una inyección intracardíaca de pentotal sódico.

Se han utilizado 4 µl para el contaje celular. Hemos desechado el 1° y 4° µl, realizando la tinción del 2° y 3° µl por separado, mediante una extensión sobre un porta utilizando un panóptico rápido (solución metálica de triarilmetano, solución tamponada de xanteno y solución tamponada de tiazina) (Química Clínica Aplicada S.A.®). Realizamos el contaje de todas las células inflamatorias de los 2 µl teñidos y obtenemos la media de ambos para el valor adjudicado a cada animal de experimentación.

Una segunda alícuota de humor acuoso conservada a -80° se ha utilizado para la determinación de la concentración de leucotrieno B4, previa eliminación de las proteínas, mediante un kit específico (laboratorios Amersham: determinación de radiación beta emitida por litio radiactivo) de radio inmuno análisis.

Por grupos y por determinación se ha realizado un estudio estadístico descriptivo (media, desviación y rango) de los resultados obtenidos y se ha aplicado el test de normalidad de Kolmogorov-Smirnoff. Se han comparado las medias de dos en dos mediante el test de la t-Student y el test de Anova para comparar los tres grupos de tratamiento.

RESULTADOS

De la valoración de la celularidad en humor acuoso (tabla I)

En el grupo II (4.360 cel/µ) observamos cómo se produce un incremento importante de las células inflamatorias en humor acuoso con una diferencia significativa (p<0,01) con respecto al grupo control (0 cel/µ). En los tres grupos de tratamiento con pranoprofeno observamos una reducción significativa de la concentración celular en humor acuoso. En el grupo III (2.675 cel/µ), en el grupo IV (2.023 cel/µ) y en el grupo V (2059 cel/µ) con un valor de p<0,01. En los tres grupos de tratamiento con pranoprofeno no observamos diferencias significativas entre ellos en cuanto a la reducción de células inflamatorias (Anova: p=0,34).

De la determinación de Lt B4 en humor acuoso (tabla II)

En la determinación de la concentración del leucotrieno B4 observamos un incremento de dicha concentración entre el grupo control (G-I: 214 pg/ml) y el grupo de endotoxina (g-II: 309.99 pg/µ) con una diferencia significativa estadísticamente (p<0,05). En el grupo de tratamiento con pranoprofeno cada 6 horas (G-III: 264.34) se observa una reducción de la concentración de leucotrieno B4 sin que existan diferencias significativas respecto al grupo de endotoxina (p>0,01). En los grupos de tratamiento cada 4 y 2 horas respectivamente (G-IV: 361 pg/ml y G-V: 334 pg/ml) se observa un ligero incremento de la concentración de leucotrieno B4 sin que existan diferencias significativas con relación al grupo de endotoxina con un valor de p>0,01. A pesar de las diferencias existentes entre la concentración de leucotrieno B4 observadas en los tres grupos de tratamiento con pranoprofeno no se observan diferencias significativas entre ellos (Anova: p=0,42).

DISCUSIÓN

El ácido araquidónico formado en el tejido inflamado por acción de las fosfolipasas A y C fundamentalmente puede seguir varias vías de metabolismo dando lugar a la formación de prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, lipoxinas, etc. (2-5).

El mecanismo de acción fundamental de los AINEs se basa en la inhibición de la ciclooxigenación del AA, por lo tanto reducen la formación de las prostaglandinas y los tromboxananos (16). Estos metabolitos están implicados fundamentalmente en la aparición de la hiperemia conjuntival, ciliar y del iris, en la ruptura de la barrera hematoacuosa (dando lugar al aumento de la concentración de proteínas en humor acuoso) y en las variaciones de la presión intraocular (6-8,12,13).

El exceso de AA existente en el tejido inflamado puede seguir las otras vías del metabolismo sobre las que no actúa el AINE, por tanto puede estimularse la formación de derivados de lipo-oxigenación (leucotrienos B, C y D, ácidos 5, 12 y 15 hidroeicosatetraenoicos y lipoxinas). Estos metabolitos tienen fundamentalmente una potente acción quimiotáctica, de adhesión y degranulación sobre las células (polimorfonucleares neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, etc.) y actúan sobre los músculos esfínter y dilatador del iris provocando miosis pupilar (6,7,9-11).

El pranoprofeno es un AINE por tanto puede reducir la ciclooxigenación del AA con la consiguiente potenciación de la lipooxigenación (17-19).

En nuestro trabajo nos hemos basado en un modelo de uveítis inducida por endotoxina, desarrollado en el Laboratorio de Inflamación Ocular de la Universidad de Alicante (20), en el que producimos una reacción inflamatoria con un aumento de la síntesis de leucotrieno B4 y un incremento de las células inflamatorias. Por lo que el modelo utilizado nos permitirá estudiar el efecto del pranoprofeno sobre la lipooxigenación del AA.

Algunos AINEs como la indometacina no sólo no reducen la concentración de células inflamatorias en humor acuoso (21 ) sino que la aumentan (17), otros como el diclofenac (22-25) reducen la concentración de células inflamatorias en humor acuoso de forma similar a la observada en nuestro estudio. En nuestro estudio hemos determinado la concentración de leucotrieno B4 a las 24 horas de administrar la endotoxina observando un incremento de este metabolito en el grupo II que no fue tratado con ningún fármaco. En los tres grupos tratados con pranoprofeno observamos cómo se produce una ligera reducción o un ligero incremento de la concentración del leucotrieno B4 sin que exista una diferencia significativa respecto al grupo de endotoxina (G-II) por lo que observamos que este fármaco no potencia la lipo-oxigenación del AA.

Similares resultados se observaron en animales tratados con diclofenac sódico (23-26), otros AINEs como la indometacina, utilizando la determinación de células inflamatorias como indicador indirecto de la lipo-oxigenación (17,21), parece ser que potencian esta vía del metabolismo. Sin embargo hay autores que consideran que no existe una correlación directa entre la concentración de leucotrieno B4 y la de células inflamatorias en humor acuoso (27). Podemos concluir por tanto que el pranoprofeno es un antiinflamatorio no esteroideo que aplicado tópicamente no potencia la lipo-oxigenación del ácido araquidónico.

BIBLIOGRAFÍA

  1. Pardo FJ. La inflamación. In: Pardo FJ; Anatomía Patológica General; Barcelona: Doyma; 1991; 1: 191-225.
  2. Kulkarni PSI Eakins HMT, Saber WL, Eakins KE. Microsomal preparations of normal bovine iris-ciliary body generate Pg 12-like but not Tx A2-like activity. Prostaglandins 1977; 14: 689-700.
  3. Kulkarni PS, Eakins KE. The enzymatic conversion of prostaglandin endoperoxides to Tx A2-like activity by human iris microsomes.Prostaglandins 1977; 14: 601-606.
  4. Kulkami PS, Srinivasam BD. Synthesis of slow reacting substance-like activity in rabbit conjunctiva and anterior uvea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1983; 24: 1.079-1.085.
  5. Weinreb RN, Polansky JR, Alvarado JA, Mitchell MD. Arachidonic acid metabolism in human trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1988; 29: 1.708-1.712.
  6. Bito LZ, Nichols RR, Baroody RA. A comparasion of the miotic and inflammatory effects of biologically active polypeptides and prostaglandin E2 on the rabbit eye. Exp Eye Res 1982; 34: 325-337.
  7. Bito LZ. Prostaglandins: Old concepts and new perspectives. Arch Ophthalmol 1987; 105: 1.036-1.039.
  8. Bito LZ, Miranda OC, Tendler MR, Resul B. Eicosanoids as a new class of ocular hypotensive agents. 3.Prostaglandin A2-1-Isopropyl ester is the most potent reported hypotensive agent on feline eyes. Exp Eye Res 1990; 50: 419-428.
  9. Stjernschantz J, Sherk T, Sears M. Ocular responses to leukotriene C4 and D4 in the cat. Prostaglandins 1984; 27: 5-15.
  10. Stjernschantz J, Sherk T, Sears M. Intraocular effects of lipoxygenase pathway products in arachidonic acid metabolism. Acta Ophthalmologica 1984; 62: 104-111.
  11. Fleisher LN, Mcgaham MC. Time course for prostaglandin synthesis by rabbit lens during endotoxin-induced ocular inflammation. Curr Eye Res 1986; 5: 629-634.
  12. Sugiyama K, Kltazawa Y, Kawai K, Enya T. Biphasic intraocular pressure response to Q-switched Nd: YAG laser irradiation of the iris and the apparent mediatory role of prostaglandins. Exp Eye Res 1990; 51: 531-536.
  13. Csukas S, Bhattacherjee P, Rhodes L, Paterson CA. Prostaglandin E2 binding site distribution and subtype classification in the rabbit irisciliary body. Prostaglandins 1992; 44: 199-208.
  14. Herbort CP, Okumura A, Mochizuki M. Endotoxin-induced uveitis in the rat: A study of the role of inflammation mediators. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 1988; 226: 553-558.
  15. Naveh N, Weissman C. Corticosteroid treatment of laser retinal damage affects prostaglandin E2 response. Invest Ophthalmol Vis Sci 1990; 31: 9-13.
  16. Podos SM. Prostaglandinsl nonsteroidal antiinflammatory agents and eye disease. Trans Am Ophthalmol Soc 1976; 74: 637-660.
  17. Kulkarni PS, Bhattacherjee P, Eakins KE, Srinivasam BD. Antiinflammatory effects of betamethasone phosphate, dexamethasone phosphate and indomethacin on rabbit ocular inflammation induced by bovine serum albumin. Curr Eye Res 1981; 1: 43-47.
  18. Fleisher LN. Effects of inhibitors of arachidonic acid metabolism on endotoxin-induced ocular inflammation. Curr Eye Res 1988; 7: 321-327.
  19. Moreira H, Mcdonnell PJ, Fasano AP, Silverman DL, Coates TD, Sevanian A. Treatment of experimental pseudomonas keratitis with cyclooxigenase and lipoxygenase inhibitors. Ophthalmology 1991; 98: 1.693-1.697.
  20. Ruiz JMI, Ruiz O, Alió JL. Uveítis inducida por endotoxina: Nuevo modelo de inyección intravítrea. Arch Soc Esp Ophthalmol 1993; 65: 547-552.
  21. Bhattacherjee P, Williams RN, Eakins KE. A comparison of the ocular anti-inflammatory activity of steroidal and nonsteroidal compounds in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci 1983; 24: 1.143-1.146.
  22. Rowland JM, Ford CJ, Della Puca RA, Cash WD. Effects of topical diclofenac sodium in a rabbit model of ocular inflammation and leukotaxis. J Ocul Pharmacol 1986; 2: 23-29.
  23. Ruiz-Moreno O, Ruiz-Moreno JM, Alió JL. Capacidad antiinflamatoria del Diclofenaco: Estudio experimental. Arch Soc Esp Oftalmol 1994; 66: 365-374.
  24. Ruiz-Moreno O, Ruiz-Moreno JM, Alió JL. Reducción de los parámetros clínico, bioquímico y celular de la uveítis experimental con el diclofenaco sódico. Arch Soc Esp Oftalmol 1994; 67: 135-142.
  25. Ruiz-Moreno O, Ruiz-Moreno JM, Alió JL, Puras A. Capacidad antiinflamatoria del Diclofenaco tópico en un modelo de uveítis inducida por endotoxina. Arch Soc Esp Oftalmol 1994; 67: 561-568.
  26. Ruiz-Moreno O, Ruiz-Moreno JM, Cortés E, Alió JL. The effect of intraperitoneal and topic sodium diclofenac on the arachidonic acid metabolism in endotoxin induced uveitis in the rabbit. Ocul Immunol Inflamm 1993; 1: 283-288.
  27. Parker JA, Goetzl EJ, Friendlaender MH. Of patients with uveitis. Arch Ophthalmol 1986; 104: 722-724.