Hospital Clínico San Carlos. Madrid. España.
(1) Licenciado en Medicina. Hospital Clínico Universitario San Carlos. Madrid.
(2) Instituto de Investigaciones Oftalmológicas Ramón Castroviejo. Madrid.
(3) Licenciado en Medicina. Instituto de Investigaciones Oftalmológicas Ramón Castroviejo. Madrid.
(4) Licenciado en Medicina. Department of Ophthalmology, National Cheng-Kung University, Taiwan.

El epitelio corneal es estratificado no queratinizado y posee células epiteliales superficiales no caliciformes que producen mucina, además expresa las queratinas específicas de córnea: K3 y K12 (1,2). El epitelio conjuntival tiene células epiteliales superficiales caliciformes que expresan mucina.

El epitelio corneal tiene una gran capacidad de regeneración. Las células basales epiteliales marcadas con Timidina radioactiva viajan a la superficie rápidamente en 4-6 días, para convertirse en células suprabasales postmitóticas que luego se pierden por apoptosis y se descaman (3). Los defectos epiteliales corneales centrales de grosor completo curan rápidamente si hay células epiteliales periféricas sanas.

El mayor avance en la biología molecular de la superficie ocular en la ultima década fue el hallazgo de Sun y colaboradores en 1986, quienes utilizando anticuerpos monoclonales contra queratina K3 (específica de córnea), demostraron que las células progenitoras del epitelio corneal o Stem Cell (SC), están en la región basal limbar (4). Anteriormente se pensaba que estaban en las empalizadas de Vogt. Esto implica que en caso de una herida del epitelio corneal, la capacidad de regeneración depende del buen estado de las SC y su microambiente limbar.

La diferenciación terminal del epitelio de la superficie ocular, empieza con el paso de las SC a células amplificadoras transitorias (TAC: Transient Amplifying Cells). Estos dos tipos de células constituyen el compartimento proliferativo, poseen características diferentes y están separadas anatómicamente, lo cual hace del ojo un modelo ideal para estudiar la regulación de las células pluripotenciales. Estos dos tipos de células basales, dan paso a las células suprabasales del compartimento diferenciativo: las células postmitóticas (PMC: Post-mitotic Cells) y las células terminales diferenciadas (TDC: Terminally Differentiated Cells). La localización limbar de las SC es la razón de que las neoplasias y displasias tengan preferencia por esa localización (5) (figs. 1 y 2).

Fig. 1

Fig. 2

El fenómeno denominado transdiferenciación conjuntival, o sea el paso de epitelio conjuntival a corneal no ha sido demostrado in vivo (6,7) ni in vitro (8,9). Los estudios al respecto han comprobado mediante cultivos de células epiteliales en medio con fibroblastos, que el nuevo epitelio no expresa las queratinas corneales K3 y K12.

La cicatrización sin transdiferenciación conjuntival, está invariablemente asociada con vascularización corneal. Esta observación llevó al descubrimiento de la vitamina A como uno de los factores sanguíneos responsable del mantenimiento del fenotipo conjuntival. De hecho la interrupción de aporte de vitamina A por la técnica denominada fototrombosis, puede llevar a la transformación del fenotipo epitelial conjuntival en uno parecido al corneal (10). No está claro si este nuevo fenotipo representa una metaplasia producida por factores extrínsecos, tampoco se conocen las posibles aplicaciones clínicas de la fototrombosis (fig. 3).

Fig. 3

La asociación entre fenotipo conjuntival y vascularización estromal corneal (conjuntivalización), sugiere la presencia de factores angiogénicos derivados de la conjuntiva o antiangiogénicos derivados de la córnea, es decir, modulación intrínseca de la expresión fenotípica.

Además de la vascularización, la membrana basal parecer ser otro factor modulador extrínseco, como lo sugiere la expresión de queratina K12 (específica de córnea) por parte de células epiteliales conjuntivales cuando se cultivan en membranas basales corneales. El hecho de que la membrana basal sea destruida en muchas patologías que ocasionan el cambio de epitelio corneal por conjuntival sugiere que alteraciones de ésta puedan ser una de las causas principales de la conjuntivalización, de allí el uso actual de la membrana amniótica (MA) para reemplazar la membrana basal destruida.

Las SC del epitelio conjuntival se han identificado principalmente en los fórnix, pero también hay estudios que las localizan en unión mucocutánea del margen de los párpados (11). No se sabe si la conjuntiva puede contener SC pluripotenciales que den lugar a ambos fenotipos. Se necesitan nuevos estudios para determinar si la expresión de las queratinas específicas son marcadores adecuados para distinguir los fenotipos conjuntivales y corneales, y en qué medida la expresión de cada fenotipo es modulada por agentes exógenos al ambiente estromal, como vascularización y membrana basal.

La citología de impresión ha servido para determinar dos tipos principales de fallos de la superficie ocular, el primero es el paso del epitelio normal no queratinizado a epitelio queratinizado, lo que se denomina metaplasia escamosa, el cual en el caso de la conjuntiva está precedido por la pérdida de células caliciformes. El segundo, es el reemplazo del epitelio corneal normal por epitelio conjuntival (conjuntivalización) y es el proceso denominado insuficiencia limbar (12).

Las células TAC tienen por el contrario una vida media corta, ciclo rápido y pueden aumentar en número por un proceso denominado amplificación transitoria. En un punto crítico, las células TAC dejan de replicarse y empiezan a diferenciarse en células suprabasales, postmitóticas y células terminales diferenciadas. El control mitótico de las SC y las TAC es diferente como lo prueban estudios de cultivos celulares (13), expresión de marcadores (14), ciclo celular (15) y respuesta al tratamiento con TPA (phorbol-éster Tumor Promoting Agents) (16).

Mediante Northern hibridization, se ha visto que las acciones autocrinas mediadas por TGF a (factor de transformación y crecimiento a ), EGFR (receptor del factor epidérmico de crecimiento), bFGF(factor básico de crecimiento de los fibroblastos)/FGFR (receptor del factor de crecimiento de los fibroblastos) y IL- 1 b/I L-1R; son producidas principalmente por células epiteliales corneales y no limbares (17). Esto lo corroboran otros estudios que muestran que el EGF (factor de crecimiento epidérmico), bFGF y aFGF son mitógenos para el epitelo corneal (18).

Además, estudios de inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales muestran que el epitelio limbar y el corneal expresan diferentes tipos de proteinquinasa C (PKC), una enzima clave en el control de la transducción de señales de crecimiento y diferenciación (19). El TPA, un activador de la PK-C, produce acciones muy diferentes sobre SC (inicia proliferación) y sobre células TAC (detiene la proliferación e inicia su diferenciación) (20). A pesar de estos interesantes descubrimientos, se necesita profundizar aún más en la forma en que las SC y las TAC usan las vías de transducción de señales de la PK-C.

Por último, la diferenciación celular de las células epiteliales corneales suprabasales postmitóticas al igual que sucede en la piel, es por apoptosis. Los factores Fas, Bar, Bcl-2, Bcl-xl e ICE son mediadores de la apoptosis y antiapoptosis expresados por las células epiteliales corneales y los fibroblastos estromales (21). Sin embargo el proceso de apoptosis también puede ser debido a la pérdida de factores de supervivencia, es decir, factores que mantienen la vida de la célula pero no su crecimiento. Esto hipotéticamente podría implicar que las células suprabasales sufren apoptosis cuando faltan dichos factores y que las SC y la TAC pueden tener acceso a diferentes tipos de factores de supervivencia o reaccionar a diferentes concentraciones, e incluso tener inhibidores variables para el mismo factor anti-apoptótico.

Una de las mayores dificultades para establecer estudios en este terreno es el hecho de que las células cultivadas in vitro generan radicales libres los cuales también llevan a apoptosis y también producen sus propios factores de supervivencia (22).

Por otra parte la apoptosis de las células malignas del linfoma de células T, puede ser inhibida cuando se cultivan con células estromales de los ganglios linfáticos, de hecho muchos estudios han mostrado que la supervivencia a largo plazo y la propagación de diferentes células epiteliales sólo es posible si se cocultivan con fibroblastos estromales. Este medio de cultivo denominado 3T3 por el tipo de fibroblastos que se usaron originalmente, ha permitido mantener y multiplicar células epiteliales de la superficie ocular en conejos y humanos, además de permitir la preservación de SC de la epidermis, folículo piloso y córnea, e incluso permitir que queratinocitos epidérmicos sean expandidos y transplantados a pacientes con quemaduras (24).

El medio de cultivo con fibroblastos, permite la supervivencia de las SC epiteliales y en el caso de las de la córnea y el limbo, al agregar suero, se produce su crecimiento clonal. Finalmente se ha visto que los fibroblastos humanos limbares producen una actividad antiapoptótica mayor que los fibroblastos corneales (25), con todo lo cual es sugerente de que las SC corneales no sólo dependen de los fibroblastos estromales sino que pueden ser moduladas por éstos. Posiblemente la disminución de esta actividad antiapoptótica sobre las SC puede llevar a su diferenciación en células TAC. Futuros estudios nos permitirán saber si esta actividad antiapoptótica se debe a diferentes factores de supervivencia o a mitógenos, y si se trata de verdaderos factores antiapoptóticos endógenos como los que se han visto en cultivos celulares.

Fig. 4

Mediante el uso de Northern hybridization, Li y Tseng, estudiaron 25 citoquinas y sus receptores, expresadas por las células epiteliales, limbares y sus fibroblastos, y encontraron cuatro patrones de diferentes de diálogo, siendo los tres primeros la red principal de intercambio de señales entre el epitelio y el mesénquima:

• Las citoquinas de tipo I permiten a las células epiteliales "hablar" con sus fibroblastos e incluyen: TGF- a , IL-1 b y PDGF-B (factor de crecimiento derivado de las plaquetas).
• Las citoquinas de tipo II permiten el diálogo cruzado entre células epiteliales y fibroblastos y son: IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina), TGF- b 1 (factor de crecimiento y transformación - b 1), TGF- b 2 (factor de crecimiento y transformación b 2), LIF (factor inhibidor de la leucemia) y bFGF.
• Las citoquinas de tipo III son expresadas por los fibroblastos para estimular la proliferación y la migración epitelial y son: KGF (factor de crecimiento de los keratocitos) y HGF (factor de crecimiento de los hepatocitos) (fig. 5) (26).

Fig. 5

El KGF es más expresado por los fibroblastos del limbo mientras que el HGF es más expresado por los fibroblastos corneales. La diferencia en la expresión de estas dos citoquinas, sugiere que KGF y HGF cumplen una importante función en la modulación de las SC y las TAC respectivamente. Ambas citoquinas son potentes mitógenos que estimulan el crecimiento paracrino de células epiteliales (27).

La acción mitogénica del KGF se extiende a casi todas las células epiteliales del organismo, incluyendo las células corneales in vitro e in vivo (28). El HGF ejerce también su acción sobre células endoteliales, melanocitos, células hematopoyéticas y neuronales. El HGF además de la acción puramente mitogénica del KGF, también estimula la migración, actúa como un factor morfogénico y ramificador endotelial.

El hecho de que el KGF y el HGF sean reconocidos como factores que intervienen en la cicatrización, hace pensar que su expresión por los fibroblastos del limbo y de la córnea respectivamente, tiene un importante papel en la función y diferenciación de las SC durante la curación de heridas.

Pero las cosas son aún más complejas: el KGF y el HGF son modulados diferencialmente por las citoquinas de tipo I (29), por ejemplo la IL1- b que es producida por el epitelio alterado o bajo algún tipo de estrés (al contrario que la expresión epitelial de TGF- a que significa bienestar celular y proliferación) puede estimular a los fibroblastos del limbo para producir KGF, que a su vez estimula la proliferación de las SC limbares, esto explicaría por qué las SC limbares aumentan durante la inflamación y la cicatrización.

Todas las citoquinas de tipo I derivadas del epitelio, sin importar que sean producidas durante el estrés epitelial o no, estimulan los fibroblastos corneales estromales para producir HGF, que a su vez puede estimular la diferenciación de las SC a células epiteliales corneales.

En conclusión, los fibroblastos limbares pueden producir factores de supervivencia y mitógenos epiteliales como el KGF y el HGF para modular las SC del limbo. Las células epiteliales de la superficie ocular pueden comunicarse con sus fibroblastos expresando diferentes tipos de citoquinas de tipo I, e indirectamente influir en ellas mismas a través de citoquinas de tipo III producidas por los fibroblastos. Además diferentes tipos de citoquinas de tipo I pueden modular la expresión de KGF y HGF.

La futura identificación de estos factores de supervivencia y mitógenos, permitirá un mejor entendimiento del diálogo de citoquinas en el microambiente limbar y la consiguiente regulación de las SC, lo cual nos ayudará a mejorar las estrategias clínicas ante las enfermedades con insuficiencia limbar de tipo II, es decir en las que hay insuficiencia de SC por alteración del microambiente limbar.

En este punto, es más fácil entender la lógica del uso de lágrimas de suero autólogo en algunos pacientes con ojo seco grave, como los de Síndrome de Sjögren, Síndrome de Stevens Johnson y Penfigoide Ocular Cicatricial, ya que éstas, además de mantener la superficie ocular húmeda, contienen proteínas lagrimales como: EGF (Factor de crecimiento epidérmico), Vitamina A, TGF- b (Factor de Crecimiento y Transformación- b ), fibronectina y varias citoquinas endógenas más (30).

Las aplicaciones clínicas de estos conocimientos no se han hecho esperar y procedimientos como los transplantes de limbo y de membrana amniótica van ganando a pasos agigantados su lugar en el arsenal oftalmológico. Pero como en cualquier otra especialidad, es en el complejo campo de batalla de la biología molecular, donde se escribe la historia moderna del arte y ciencia de la medicina.