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CAPÍTULO 30 ANÁLISIS BIOQUÍMICO DE LA LÁGRIMA Luis Rivas Jara |
| El diagnóstico de un síndrome de ojo
seco mediante las molestias subjetivas descritas por el paciente, la exploración
biomicroscópica y las pruebas clínicas, es difícil de realizar. Históricamente, la
evaluación de estos pacientes ha sido basada en los hallazgos clínicos, pero ninguna de
las pruebas clínicas, por sí mismas, puede determinar la enfermedad, por lo que para un
mejor y más completo diagnóstico deber ser complementadas con pruebas de laboratorio,
sobre todo, con las morfológicas (citología de impresión y biopsia). En el ojo seco, al estar producido por alteraciones en la glándula lagrimal (hiposecreción acuosa) y/o en la superficie ocular (hiposecreción mucínica o epiteliopatías), la exactitud y rapidez en la obtención de los valores de las pruebas bioquímicas contribuye a un más completo e inmediato diagnóstico del estado de la película lagrimal en el paciente; mientras que las pruebas histológicas son insustituibles para el diagnóstico del estado morfofuncional de la glándula lagrimal y de la superficie ocular. Todos los tratamientos convencionales han sido enfocados hacia un restablecimiento de los componentes deficientes de la lágrima, prestándose poca atención a los cambios de la superficie epitelial ocular. El conocimiento de las alteraciones celulares de la pared córneo-conjuntival permitiría un avance significativo en el tratamiento de pacientes con ojo seco.
PRUEBAS DE LABORATORIO La capa serosa de la película lagrimal es la de mayor volumen. En personas sanas, el 98,3% es agua y el 1,7% restante lo forman compuestos en disolución: inorgánicos, carbohidratos, sustancias nitrogenadas proteicas y no proteicas, y lípidos y derivados. Contiene electrólitos inorgánicos, principalmente cloruro sódico y componentes macromoleculares, entre los que destacamos: lisozima, lactoferrina, peroxidasas, inmunoglobulinas, albúmina y glucoproteínas. La gran utilidad de muchas de estas pruebas, como el proteinograma, la cristalización y la osmolaridad de la lágrima, está en que pueden ser detectadas antes de que la hiposecreción sea patente. Entre las numerosas pruebas de laboratorio existentes que miden directa o indirectamente los componentes de la película lagrimal, destacamos, por su importancia en el diagnóstico, las siguientes:
1. Osmolaridad de la lágrima Es una prueba que mide la estabilidad de la película lagrimal, determinada por el número de moles de partículas osmóticamente activas por litro de lágrima (mOsm/litro). Von Bahr (1941) fue el primero en sugerir que la osmolaridad está incrementada en pacientes con ojo seco. Balik (1952) sugirió que estas enfermedades debían estar causadas por un incremento de la concentración de cloruro sódico en la película lagrimal. Pero, fueron Mishima y cols. (1971) los primeros que pudieron demostrar la elevación de la osmolaridad lagrimal en pacientes con ojo seco. En la actualidad se acepta que la osmolaridad de la película lagrimal es una característica dependiente de la concentración iónica y, por lo tanto, del consiguiente incremento de la concentración de cloruro sódico en la lágrima. La medida de la osmolaridad es una de las mejores pruebas para el diagnóstico de la sequedad ocular (Roberts, 1991), sobre todo en los estadíos iniciales de la enfermedad si existen cambios histológicos en la superficie ocular (Gilbard y cols., 1979; Rolando y cols., 1990); también, es muy útil para determinar si hay relación entre el nivel de tonicidad de la película lagrimal y la patogénesis de la enfermedad; también está aceptado que la osmolaridad en los pacientes con ojo seco es mayor que en las personas asintomáticas, debido a una mayor evaporación de la película lagrimal. Su valor aumenta con relación a la severidad de la enfermedad, pero los cambios que producen estas lágrimas hiperosmolares en la córnea y conjuntiva tienen un papel todavía incierto en la patogénesis de la enfermedad, aunque el efecto más severo es la mayor exposición de la superficie ocular al aire (Lucca y cols, 1990b; Rivas y cols., 1993 y 1995). La disfunción de las glándulas de Meibomio, independientemente de que exista o no un trastorno de las glándulas lagrimales, también puede incrementar la osmolaridad de la película lagrimal y producir un cuadro de ojo seco (Gilbard, 1994). Debido a las limitaciones de las técnicas de recogida y estudio del fluido lagrimal, los investigadores tardaron muchos años en demostrar que la osmolaridad de la película lagrimal estaba aumentada en el ojo seco, ya que el valor de la osmolaridad está relacionado de forma inversa al flujo secretado por la glándula. Estas técnicas requerían tomar grandes volúmenes de lágrima y ello, a su vez, obligaba a establecer contacto con el globo ocular y a estimular la secreción lagrimal. Sólo se pudo comprobar el aumento de la osmolaridad una vez que se desarrolló una técnica para obtener muestras de lágrima de tan sólo 0,1 microlitro aproximadamente (Gilbard y cols., 1987), aunque en la mayoría de los centros hospitalarios es necesario alrededor de 0,2 microlitros para realizar su medición. Esta prueba está sujeta a diversos factores que alteran los resultados, pudiéndose producir errores en la recogida, por lagrimeo reflejo. Para ello, las muestras de lágrima se deben recoger en el menisco lagrimal inferior con la ayuda de micropipetas en L diseñadas especialmente para penetrar en el menisco sin tocar el globo ni el párpado (Gilbard y cols., 1987), para evitar la estimulación de la lágrima. Otro problema puede estar en el almacenamiento, debido a la evaporación. La muestra de la lágrima se debe conservar en un tubo con tapón sobre un lecho de hielo para evitar la evaporación. De igual manera, la medición se debe realizar inmediatamente después de la obtención, siguiendo una técnica meticulosa (Nelson y Wright, 1986). La osmolaridad se mide por descenso del punto de congelación, utilizando para ello un osmómetro de última generación (Gilbard y Farris, 1983). En los pacientes con una prueba de Schirmer I corta (<3 mm), no es aconsejable realizar esta prueba, pues se emplea excesivo tiempo para la obtención de los 0,2 microlitros de lágrima, incrementándose notablemente los factores que alteran los resultados de la osmolaridad. Hay muchos casos donde es imposible la recolección de la cantidad mínima, aún con estimulación refleja. A pesar de la distinta metodología en la recogida de la lágrima, estudios recientes manifiestan que no hay diferencias significativas entre los valores de la osmolaridad con y sin estimulación refleja (Sanz y cols., en prensa). El valor normal está comprendido entre 300 y 310 mOsm/l. En pacientes con ojo seco con sequedad leve es aproximadamente de 320 mOsm/l; los de sequedad moderada, alrededor de 330 mOsm/l; y los de sequedad grave, es superior a 340 mOsm/l (Murube y Cortés 1989). Otros autores no gradúan la enfermedad, considerando que valores superiores a 312 mOsm/l son compatibles con el diagnóstico de ojo seco (Nelson y Wright 1986). De forma semejante, Gilbard (1994) considera valores normales los comprendidos entre 300-307 mOsm/l.
2. Determinación de electrólitos específicos Actualmente, existe un creciente reconocimiento de la importancia de los electrólitos de la lágrima para mantener la estabilidad de la película lagrimal; aumentando así el interés por la composición electrolítica específica de la película lagrimal normal y alterada (Gilbard y cols., 1989c). Las concentraciones de electrólitos se determinan mediante microtécnicas que permiten realizar todas las mediciones en cada una de las muestras de lágrima. No es una técnica muy habitual, ya que al igual que en la osmolaridad, para obtener una cantidad de muestras suficiente es preciso un tiempo de recogida relativamente largo o estimular la secreción de la glándula lagrimal. Otro problema es que las concentraciones de electrólitos en la lágrima varían con el ritmo de secreción de la glándula, lo que limita la capacidad de estos estudios para medir con precisión dichas concentraciones en la película lagrimal normal y patológica (Rismondo y cols., 1989). Los tiempos de recogida prolongados crean un problema suplementario en cuanto a la medición del bicarbonato, porque el gas CO2 puede escapar rápidamente al aire, lo cual reduce la cantidad de bicarbonato en la muestra. La recogida en frasco con tapón en lecho de hielo facilita una medida más correcta. El bicarbonato se determina con un picapnotermo. Mediante espectrometría de absorción atómica puede medirse la concentración de sodio, potasio, calcio y magnesio en la lágrima. En pacientes con ojo seco, estos electrólitos pueden estar alterados (Gilbard y Rossi, 1990 y 1992). Se ha descrito que en ojos de pacientes con trastornos en las glándulas lagrimales, la lágrima tenía una osmolaridad normal, mientras la concentración de sodio era alta. La determinación de este electrólito podría indicar las primeras fase del ojo seco (Maurice, 1971). Esta observación indicaría que el agua necesaria para estabilizar la película lagrimal la debería obtener de córnea y conjuntiva, lo que implicaría una grave alteración morfofuncional, no apreciada por pruebas clínicas ni morfológicas. Las cifras normales de los electrólitos más significativos en la película lagrimal, expresada en mOsm/l, son las siguientes: sodio (133,0), potasio (24,0), bicarbonatos (32,8), calcio (0,80) y magnesio (0,61). La edad es una variable que incrementa estos valores significativamente para todos los parámetros excepto el potasio. Se indica un incremento previsto de unos 0,9 mOsm/l. En el ojo seco, las concentraciones de sodio, potasio, bicarbonatos, calcio y magnesio se incrementan de forma uniforme, aproximadamente un 2%, salvo el del potasio. En pacientes con trastornos de las glándulas lagrimales, la concentración de potasio, bicarbonatos, calcio y magnesio aumenta aproximadamente un 3,5% con respecto a los controles. Sin embargo, el sodio de la película lagrimal aumenta de forma desproporcionada, hasta un 6,8%, con respecto a los controles. Estos valores se ven modificados con la edad, de la misma proporción que en las personas sanas (Gilbard, 1994). El potasio, según Balik 1968ab, cuyos valores normales calcula en 30'3 m g/mg de lágrima, desciende en la KCS a 24'3 m g/mg.
PROTEINAGRAMA POR ELECTROFORESIS La utilización de la electroforesis de las proteína lagrimales sobre acetato de celulosa es una técnica muy simple, que se puede realizar en cualquier laboratorio de análisis clínicos. Es muy rápida y de fácil lectura. Las muestras de lágrima se recogen de igual forma que para la determinación de la osmolaridad, siendo necesarios aproximadamente 5 microlitros. La electroforesis permite separar las proteínas lagrimales, desde el cátodo hasta el ánodo, en cuatro picos principales: la lisozima, la lactoferrina (junto a la que se sitúan las inmunoglobulinas), las proteínas comunes a la lágrima y al suero, y la albúmina (figura 30-1). La electroforesis en gel de poliacrilamida permite separar muchos más conponentes (figura 30-2).
Al igual que la alteración de la osmolaridad de la lágrima, la disminución de la proteínas lagrimales principales puede ser detectada antes de que la hiposecreción sea patente.
DETERMINACIONES POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL Lisozima La lisozima o muramidasa es un componente abundante de la lágrima normal, alcanzando valores medios de 1'75g/l, y siendo por tanto el 25% de las proteínas lacrimales. El nivel de lisozima en lágrima puede medirse por medio de varias técnicas bioquímicas como son la electroforesis, electroinmunodifusión, ELISA, inmunodifusión radial, difusión en agar y análisis turbidométricos. De forma indirecta, se utiliza un análisis bacteriolítico para calcular su concentración. En clínica dacriológica, la lisozima suele cuantificarse colocando con pinza en la cuenca lacrimal del paciente un disco de papel absorbente. Cuando se empapa con la lágrima del paciente, se coloca en una placa de agar con cultivo de Micrococcus lysodeikticus. El halo de lisis formado durante 24 horas a 37ºC mide la actividad de la muramidasa, y de ello se deduce su cantidad. Van Bijsterveld ha tipificado la prueba usando discos de papel de filtro Whatman-3, de 6 mm de diámetro; con ellos, el diámetro del halo de lisis de una persona normal es de 21'5 mm. Para van Bijsterveld 1973, la prueba de difusión en agar con un halo de lisis inferior a 21'5 mm acierta en el diagnóstico de conjunctivitis sicca en el 99% de los casos Otro método de determinación de la lisozima es el turbidométrico (Ronen et al 1975), que valora la disminución de la densidad óptica que la lisozima de la lágrima del paciente produce en una suspensión de Micrococcus lysodeikticus. Con la técnica de la electroforesis, se considera expresión de sequedad severa cuando la lisozima tienen valores inferiores a 0,5 g/l; sequedad media, hasta 1 g/l; sequedad ligera, hasta 1,5 g/l; y cantidad normal alrededor de 1'75 g/l (Murube y Cortés, 1989). Otros autores consideran indicativos de la existencia de un ojo seco valores de lisozima inferiores a 1 g/l (Nelson, 1994) En circunstancias fisiológicas, la lisozima lagrimal disminuye en el anciano. En circunstancias patológicas la lisozima disminuye en las conjuntivitis y en el ojo seco. Las conjuntivitis suelen provocar descenso de muramidasa en lágrima, según determinaron Cavka et al 1929, y después corroboraron la mayoría de los autores. En los casos de SS, y en general de KCS, hay un bajo contenido de lisozima (Rindello 1936; Erickson 1955; McEwen et al 1955; van Bijsterveld 1969, 1973,1974; Pietsch et al 1973; Mukai 1975; Mackie et al 1976; Avisar et al 1979; Ueda et al 1979, Montero et al 1990b; etc). Algunos autores no lo han encontrado (Krause 1959) o sólo lo han encontrado en el 50% de los pacientes de ojo seco (Zittoun et al 1978). Según Okawada et al 1979, la concentración media de lisozima en el SS fue 1'21 g/l, y tras 10 semanas de tratamiento con prednisolona subió a 1'93 g/l. Cuando la determinación en sujetos normales se hace bajo anestesia tópica, los niveles de lisozima bajan un poco (van Bijsterveld et al 1983) o no ofrecen diferencias significativas (Gómez et al 1997). Pero cuando las determinaciones se hace en pacientes con ojo seco asociado a blefaritis, los valores de lisozima bajan algo antes de la anestesia tópica (1'21mg/g) y mucho tras la anestesia tópica (1'04 mg/g). Para Pérez Domingo 1996, la prueba más específica y sensible para diagnosticar un ojo seco es la determinación de lisozima lacrimal bajo anestesia tópica
Lactoferrina La lactoferrina es una proteína que alcanza en lágrima normal valores medios de 1'75 g/l, constituyendo otro 25% de las proteínas lacrimales normales. Es producida principalmente por los acinos de la glándula lagrimal. La lactoferrina se puede determinar por electroforesis, pero el método más usado en clínica dacriológica es el deinmunodifusión radial, aunque resulte más lento. La primera tipificación de la prueba de inmunodifusión se hizo por Janssen et al 1982. Los inmunoplatos más usados son los de Culemborg, Eagle Visión y MacKeen (LactoplateTM JDC, Culemborg, Países Bajos. Eagle Vision, Memphis, EEUU). Se coloca con pinza un disco de papel de 4 mm de diámetro en el fórnix inferior, sin anestésico (aunque el valor de lactoferrina es aproximadamente el mismo con y sin anestesia tópica: 1'58-1'55 mg/g. ), durante 3-5 minutos. Se retira y se coloca sobre el Lactoplate de gel de agarosa con anticuerpos anti-lactoferrina lacrimal humana para inmunodifusión radial, donde se mantiene durante 3 días a temperatura doméstica. Al fin de ellos se mide el diámetro de precipitación antígeno-anticuerpo, que se lleva a una tabla de conversión que determina los g/l de lactoferrina en lágrima. La concentración de lactoferrina es proporcional al cuadrado del diámetro del anillo de precipitación. En personas con ojo secos es aproximadamente la mitad que en personas sanas. Para Murube y Cortés (1989) los valores normales oscilan alrededor de 1'75 g/l; por debajo de 1'5 g/l son valores deficitarios que probablemente se corresponden con un ojo seco; por debajo de 1 g/l hay una evidente descenso patológico; y por debajo de 0'5g/l suelen corresponderse con un ojo seco grave. Otros autores consideran que son indicativos de ojo seco los valores inferiores a 1 g/l (van Bijsterveld 1983, Nelson, 1994). Cortina et al 1996 encontraron que en pacientes de KCS los valores de lactoferrina estaban bajo 0'9 g/l 90 en el 66% de los pacientes, y sobre ellos en el 44%. Consideran por tanto la prueba como de escasa sensibilidad. Sin embargo, consideran que los bajos niveles de lactoferrina en lágrima se asocian estrechamente con las KCS de origen autoinmune.
IgA Aunque la IgA desciende en la lágrima de pacientes con ojo seco, su determinación por inmunodifusión radial se ha usado poco, pues no se ha demostrado que aporte más evidencias de ojo seco que la lisozima y la lactoferrina. Los valores normales de IgA en lágrima, expresados en mg/100 ml, han sido deterteminados en 7 (Chodirker et al 1963), 21'97 (Jordano et al 1973) y 24'30 (Murube et al 1977). Cuando la producción lacrimal se estimula reflejamente irritando el ojo, los niveles de IgA bajan; así, la moderada irritación de la conjuntiva por el contacto con la boca de la micropipeta recolectora de lágrima, hizo que los valores de IgA en lágrima pasaran a ser, en medidas de 10 en 10 minutos, 18'1, 10'5, 6'1 y 4'6 mg/100ml (Murube et al 1976). Se debe esto probablemente a que la IgA secretoria se sintetiza o dimeriza en la glándula lacrimal, y la hipersecreción lacrimal agota antes la capacidad de sintetizar proteínas que de eliminar agua (Murube 1979).
OTRAS DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS Existen otros componentes lacrimales que se alteran en el ojo seco, pero cuya determinación no está incluida en las pruebas diagnósticas habituales, por lo que su conocimiento tiene más un interés de investigación que clínico. Así, la ceruloplasmina alcanza en lágrima normal valores medios de 35 mg/l, siendo por tanto el 0'5 % del valor proteico total de la lágrima; en el síndrome de Sjögren algunos autores han encontrado valores ligeramente aumentados. También se ha visto aumentada la N-acetil- b -glucosaminidasa en algunos casos de SS (Maezawa et al 1979). Balik 1963 observó que la glucosa en lágrima de los pacientes con KCS es superior a la normal. El mismo Balik 1959 observó que el cociente concentración de urea en lágrima/concentración de urea en suero es mayor en los pacientes de KCS que en los sujetos normales
AGRADECIMIENTOS El autor agradece la ayuda prestada por las Dras Ana Isabel Sanz Sanz y María Antonia Oroza Alonso en la realización de este capítulo. |
