ACTUALIZACIÓN  EN  CIRUGÍA  OFTÁLMICA  PEDIÁTRICA

El retinoblastoma es un paradigma de predisposición genética al cáncer. Ya en 1971 Knudson anticipó, basándose en la distribución de retinoblastomas bilaterales y unilaterales en virtud de su edad de presentación, que el tumor debería ser causado por la inactivación de un gen por dos eventos mutacionales independientes (1). En 1986 se identificó y clonó el gen responsable de este tumor (denominado RB1), demostrándose que se encontraba mutado en estos tumores, y en consecuencia la hipótesis inicial de Knudson (2).

En condiciones normales, la proteína codificada por este gen es un regulador negativo de la proliferación celular. Su inactivación conduce, por tanto, a la eliminación de esta barrera produciéndose un crecimiento celular desordenado que finalmente desemboca en la formación del tumor. A estos genes que desempeñan una regulación negativa sobre el ciclo celular se les denomina genéricamente genes supresores de tumores, ya que su inactivación aumenta la probabilidad de desarrollar un cáncer. RB1 también está implicado en el desarrollo de otros tumores, como osteosarcomas, sarcomas de tejidos blandos y cáncer de pulmón microcítico, entre otros (3-5).

 
Figura 1. Hipótesis de Knudson de los dos eventos mutacionales. En los retinoblastomas no hereditarios (A), el ADN constitucional presenta dos alelos normales del gen del retinoblastoma (RB1). Durante la embriogénesis, una célula de la retina adquiere la primera mutación en una de las dos copias del gen (rectángulo negro). Posteriormente, la otra copia del gen es inactivada en la misma célula por una segunda mutación. Por el contrario, en los retinoblastomas hereditarios (B), la primera mutación está presente en el ADN constitucional (heredada a través de la línea germinal), y por lo tanto, todas las células de la retina contienen solo una copia normal del gen. La inactivación de esta copia en cualquier célula de la retina conduce a la formación del tumor.

El modelo genético aceptado actualmente sugiere que dos mutaciones, afectando a cada una de las dos copias del gen del retinoblastoma, son suficientes y necesarias para el desarrollo del tumor (figura 1). La primera de estas mutaciones puede aparecer en los precursores de las células de la retina y en consecuencia estar presente únicamente en las células tumorales (retinoblastomas denominados no hereditarios) o estar presente en todas o la mayoría de las células del organismo (retinoblastomas hereditarios). La segunda de las mutaciones, que inactiva la copia restante del gen, ocurre siempre en las células de la retina, conduciendo a la formación de un tumor con ambas copias del gen inactivadas.

Aproximadamente el 60% de los retinoblastomas son no hereditarios, correspondiendo el 40% restante a retinoblastomas hereditarios. Todos los retinoblastomas no hereditarios son unilaterales y en ellos no hay posibilidad de transmitir la enfermedad a la descendencia, ya que las mutaciones en el gen RB1 están presentes únicamente en las células que forman el tumor. De los retinoblastomas hereditarios, es decir, aquellos en los que las células constitutivas del organismo son portadoras de una mutación, un 70% son bilaterales. El 30% restante son tumores unilaterales (figura 2).

 
Figura 2. Genética del retinoblastoma y formas de presentación.

Ya que los pacientes con retinoblastoma hereditario son portadores de mutaciones constitucionales, estos pueden transmitir la enfermedad a la descendencia. Los niños que han heredado de sus padres una copia mutada del gen del retinoblastoma tienen una probabilidad del 90% de desarrollar el tumor, que en la mayoría de los casos será bilateral. La cuarta parte de los retinoblastomas hereditarios tienen una historia familiar de la enfermedad. El resto de los casos de retinoblastoma hereditario corresponden a la aparición de nuevas mutaciones en línea germinal en el paciente, las cuales no estaban presentes en sus progenitores, pero que si pueden ser transmitidos a su descendencia en el futuro (figura 2). Sin embargo, la ausencia de mutaciones en el ADN constitucional de sangre periférica de los progenitores —criterio habitual de no heredabilidad de la enfermedad— debe revisarse a la luz de la existencia de casos de mosaicismo. En estos, la mutación puede estar presente en las células germinales de los progenitores (p. ej. en los espermatocitos del padre), y en consecuencia pueden transmitir la mutación a sus descendientes (6).

La mayoría, si no todas las mutaciones que predisponen al retinoblastoma, son el resultado de cambios genéticos que interfieren con la función normal del gen. En la tabla 1 se resumen los tipos de mutaciones identificadas.

Aproximadamente un 5% de las mutaciones son alteraciones cromosómicas extensas tales como deleciones, translocaciones o inversiones cromosómicas, muchas veces asociadas al denominado síndrome de 13q [retraso mental, microcefalia y otras anormalidades sistémicas (7)] que pueden ser detectadas mediante técnicas de citogenética con microscopía convencional o mediante hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) (mutaciones microscópicas).

Otros tipos de mutaciones son deleciones de relativamente grandes fragmentos de ADN, presentes en el 15%-20% de los casos, pero que son lo bastante pequeñas para no poder ser detectadas mediante las técnicas citogenéticas habituales (mutaciones submicroscópicas). Estas alteraciones son frecuentemente detectadas mediante técnicas de hibridación de ADN (Southern-blot) (8).

Sin embargo, la mayoría de las mutaciones corresponden a cambios sutiles en la secuencia del ADN, ésto es, a sustituciones o pequeñas inserciones o deleciones de unos pocos nucleótidos. Estas alteraciones sólo pueden ser detectadas mediante técnicas de biología molecular complejas tales como el análisis de polimorfismos conformacionales de ADN de cadena sencilla (PCR-SSCP) y secuenciación (9-14). La consecuencia mas habitual de estas mutaciones es la formación de proteínas truncadas no funcionales debido a la aparición de codones de parada prematuros (15).

Los pacientes con antecedentes familiares de la enfermedad, retinoblastoma bilateral, y aproximadamente un 15% de los pacientes con retinoblastoma unilateral son portadores de mutaciones constitutivas en uno de los alelos del gen del retinoblastoma que les predispone a desarrollar retino blastoma.

Hasta la llegada de las modernas técnicas de análisis del ADN, solamente era posible determinar de manera empírica la probabilidad de tener descendencia con riesgo de desarrollar retinoblastoma, basándose en grandes estudios poblacionales (16). Por el contrario, los estudios moleculares permiten determinar el genotipo de cada uno de los miembros de una familia, permitiendo evaluar el riesgo real de desarrollar la enfermedad. Por tanto, el diagnóstico molecular en pacientes con retinoblastoma y en sus familiares es de inestimable valor, especialmente en lo referente al consejo genético.

A continuación se comentan brevemente los tres tipos de retinoblastoma hereditario en los que está indicado la realización de un estudio molecular.

El diagnóstico molecular en pacientes con retinoblastoma familiar y en todos los familiares en primer grado (padres, hermanos y descendientes) es altamente recomendable e informativo, ya que es posible identificar que miembros de la familia son portadores de la mutación que predispone a desarrollar retinoblastoma y cuales no (17). En estos casos, el análisis molecular consiste en un estudio de ligamiento —una técnica que permite determinar que alelo segrega con la enfermedad y es portador de la mutación— realizado a partir del ADN de muestras de sangre periférica de los diferentes miembros de la familia (sanos o no) (figura 3).

 
figura 3. Estudio de ligamiento en un caso de retinoblastoma familiar. En este familia, tanto la madre (RB122) como la paciente (RB123) fueron diagnosticadas de retinoblastoma unilateral. El análisis de cuatro marcadores genéticos próximos al gen del retinoblastoma permitió determinar el alelo que segregaba con la enfermedad y en consecuencia, el que portaba la mutación que predisponía a desarrollar el tumor en esta familia (recuadro). La hermana menor de la paciente (RB124) heredó el alelo no mutado de la madre, y por lo tanto no tiene riesgo de desarrollar retinoblastoma.

Por definición, un retinoblastoma bilateral indica la presencia de una mutación germinal. El estudio del ADN constitucional de pacientes con retinoblastoma bilateral esporádico permite, en más del 75% de los casos, identificar la mutación causante de la enfermedad (figura 4).

 
Figura 4. Estudio molecular en un retinoblastoma bilateral esporádico. (A) Electroforesis del exón 8 del gen del retinoblastoma amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (padre, carril 1; madre, carril 2; paciente, carril 3). Obsérvese que el paciente presenta dos bandas, la mayor de las cuales corresponde al alelo mutado. El aislamiento de estas bandas y su secuenciación posterior (derecha) permitió caracterizar con exactitud la mutación, formada por una deleción de 5 nucleótidos y una inserción de 18. (B) Como consecuencia de la mutación se destruyó la secuencia específica reconocida por una enzima de restricción de ADN. Obsérvese que la enzima corta el alelo normal en dos fragmentos (bandas inferiores), pero no el alelo mutado presente únicamente en el paciente (banda superior). Ambos progenitores fueron portadores exclusivamente de alelos normales, por lo que la probabilidad de tener otro hijo con retinoblastoma era la misma que la incidencia de la enfermedad en la población normal.

Estos estudios se realizan a partir de una muestra de sangre periférica del paciente, utilizando un conjunto de técnicas más o menos complejas de análisis de ADN (Southern-blot, polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricción o RFLP, reacción en cadena de la polimerasa o PCR, secuenciación, etc.) con el fin de abarcar todas las formas diferentes de mutaciones (8-15). El interés de estos estudios estriba en la caracterización de la mutación y en la presencia o ausencia de esta en el ADN constitucional de los progenitores, ya que se pueden dar casos de portadores asintomáticos (retinoblastomas de baja penetrancia) (18-19). Sin embargo, la ausencia de la mutación en el ADN de sangre periférica de los progenitores no permite descartar totalmente la posibilidad de transmisión de la mutación a la descendencia debido a la existencia de casos de mosaicismos (individuos en los que la mutación, por ejemplo, no está presente en las células sanguíneas pero si en las células germinales). En estos casos puede ser de interés el estudio de una muestra de semen para determinar si la mutación está presente en los espermatocitos (6).

En ausencia de historia familiar de la enfermedad, sólo un 15% de los retinoblastomas unilaterales son portadores de mutaciones en el ADN constitucional. En estos casos, el análisis molecular debe ser realizado inicialmente en una muestra congelada del tumor, para caracterizar las mutaciones presentes en este, y posteriormente comprobar su presencia o ausencia en el ADN de sangre periférica (20).

Si una de las mutaciones del tumor es identificada en el ADN constitucional, entonces el retinoblastoma es hereditario. Como en el caso anterior, la mutación puede también ser estudiada en los progenitores, y determinar si se trata de una mutación de novo. Sin embargo, como consecuencia de una mejoría sustancial en los métodos de detección y tratamiento, el número de enucleaciones está disminuyendo progresivamente, haciendo cada vez mas difícil la obtención de tejido tumoral para este tipo de estudios.

La realización de los análisis genéticos en pacientes con retinoblastoma hereditario presenta varias ventajas. Primero, al caracterizar las mutaciones causantes de la enfermedad, es posible identificar que miembros de una familia son portadores de la mutación y tienen riesgo de desarrollar el tumor. Así, los niños no portadores de un gen mutado pueden librarse de los frecuentes e incómodos exámenes oftalmológicos, mientras que puede incrementarse la vigilancia en aquellos que son portadores, aumentando las probabilidades de detección precoz y en consecuencia de conservar la visión (21). Segundo, la estrategia molecular, no solo aporta resultados de valor clínico, sino que también resulta menos costosa al seleccionar los pacientes de alto riesgo susceptibles de monitorización convencional. En un trabajo reciente, el estudio molecular resultó hasta cuatro veces menos costoso que los protocolos convencionales al uso (22). Por último, el diagnóstico molecular es la base imprescindible para llevar a cabo un consejo genético documentado, el cual comienza a ser demandado por los padres, cada vez con mas insistencia.

En resumen, el diagnóstico molecular en pacientes con retinoblastoma hereditario debe ser una parte integral de su tratamiento. Sin duda, su incorporación a la práctica clínica debe incrementar la eficacia de los tratamientos y la calidad de vida de los pacientes y sus familiares.

Este trabajo ha sido financiado con ayudas del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS98/1349), Comunidad Autónoma de Madrid (081/0024/1998) y Rhône-Poulenc-Rorer. Agradecemos también a P. Nebrada y a N. Gómez por la asistencia técnica prestada.

Igualmente a la Dra. García de Miguel y al Dr. Abelairas del Hospital Infantil La Paz por integrarnos dentro de la Unidad de Retinoblastomas de La Paz.

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