Dres. Polo Llorens V1, Pinilla Lozano I2, Larrosa Povés JM2, Ferrer Torres J3, Cuevas Andrés R1, Honrubia López FM2
Hospital Miguel Servet. Zaragoza. España.
(1) Licenciado en Medicina. Servicio de Oftalmología.
(2) Doctor en Medicina. Servicio de Oftalmología.
(3) Licenciado en Medicina. Servicio de Microbiología.
Introducción
Las sustancias medicamentosas, aplicadas de forma tópica en el globo ocular, deben superar distintos obstáculos antes de que puedan ejercer su efecto terapéutico a nivel del estroma corneal o en la cámara anterior.
La penetración de cualquier medicamento se ve afectada por su concentración sobre la superficie corneal y por el tiempo de contacto, que en el caso de aplicaciones tópicas, es la concentración alcanzada en las lágrimas y la persistencia de la medicación en las mismas.
El epitelio corneal constituye una barrera física que condiciona la penetración intraocular de estas medicaciones. Su estructura celular, con alto contenido en membranas lipídicas, supone una limitación a la penetración de sustancias polares o hidrofílicas.
Se conoce que los extensos desbridamientos del epitelio corneal facilitan y aumentan la penetración de sustancias hidrofílicas, tanto a nivel del estroma corneal como de la cámara anterior (1,2). Sin embargo, no se sabe la relación existente entre el área de superficie del defecto epitelial y la penetración de sustancias en ambas localizaciones.
El ciprofloxacino es un antibiótico de amplio espectro de la familia de las fluorquinolonas, que inhibe la síntesis del DNA bacteriano, a través de la inhibición de la DNA girasa, isómera necesaria para el enrollamiento de la molécula de DNA.
El objetivo de este estudio es determinar la relación existente entre la penetración intraocular de ciprofloxacino y las pérdidas de diferentes áreas de superficie epitelial (25%, 50%, 75% y 100%) en un modelo experimental en el conejo.
Material y métodos
El trabajo experimental fue llevado a cabo en las instalaciones del Laboratorio Experimental del Hospital "Miguel Servet" de Zaragoza, autorizado por el Ministerio de Agricultura y que figura en el registro de centros de usuarios de animales de experimentación.
Para la realización del presente estudio se han utilizado un total de 45 conejos pardos pigmentados, de peso comprendido entre 2.500 y 3.500 gr.
Procedimiento quirúrgico experimental
Los animales fueron anestesiados, mediante la aplicación de una inyección intramuscular de Ketamina 0,7 cc/kg y Xilacina 0,2 cc/kg.
Usando un cuchillete quirúrgico de 45º (Alcon, Inc.) se procedió al marcaje de los cuatro cuadrantes corneales, dividiendo de esta manera la superficie corneal en 4 sectores equivalentes, cada uno de los cuales representaba el 25% de la superficie total. Posteriormente, se realizó un desbridamiento del epitelio, constituyéndose 5 grupos de estudio:
En todos los grupos estudiados, se realizaron instilaciones de colirio de ciprofloxacino al 0,3% (3 mg/ml), inmediatamente después de realizarse el desbridamiento epitelial y sucesivamente cada 2 horas, hasta completar un total de 6 horas, al término de las cuales se realizó el sacrificio de los animales (mediante la administración intravenosa de penthotal sódico).
De cada ojo sometido al tratamiento se obtuvieron, bajo control microscópico, muestras de humor acuoso (HA) (mediante aguja de 23 G) y botones corneales de 8 mm, mediante trepanación.
Cuantificación de la concentración de antibiótico
Para estudiar la actividad antiobiótica de las diferentes muestras oculares se empleó la técnica de bioensayo, variante del método descrito por Golden y Baumm, utilizada en estudios previos. Para su realización se escogió la cepa de Escherichia Coli ATCC 25922, que es sensible al antibiótico en estudio. Se sembraron con dicha cepa, placas de cultivos convencionales con medio de Müller-Hinton y sobre este agar se colocarán las tomas en estudio. Los botones corneales fueron sembrados directamente sobre el agar; para el estudio de los niveles de humor acuoso, se utilizaron 20 microlitros de cada muestra colocados sobre el agar en un disco de difusión de 5 mm de diámetro. Las placas se cultivaron a 37ºC durante 24 horas procediéndose a la lectura de los halos de inhibición bacteriana alrededor de las muestras. Estos halos de inhibición guardan una proporción con la cantidad de antibiótico presente. Las siembras de acuoso se realizaron por duplicado. Los halos se calcularon de la media de 3 observaciones realizadas por distintos investigadores.
Para correlacionar los mm de inhibición con los microgramos de ciprofloxacino, se realizaron lecturas de los halos inducidos por cantidades conocidas de ciprofloxacino obtenidas a partir de diluciones progresivas del colirio original. A partir de los pares de valores (mm de inhibición, µgr de ciprofloxacino) y con ayuda informática, se calculó la fórmula de una curva patrón que los relaciona, curva del tipo y=[a+bln(x)], en la que x son los microgramos de antibiótico e y los mm de inhibición (a=75,75; b=3,77). La curva presentó un coeficiente de determinación r2 superior a 0,9 (R2=0,97).
En todas las placas se introdujo un disco estándar de 10 microgramos de ciprofloxacino como control (Difco).
Análisis estadístico
Los distintos parámetros fueron recogidos mediante una base de datos creada en el programa dBase III+ (Ashton-Tate,1988) y procesados estadísticamente con el programa Rsigma (Horus Hardware,1990). Se han utilizando el test de la t de student y análisis de la varianza (las diferencias significativas eran analizadas mediante la prueba de Newman-Keuls), considerándose un nivel de p<0,05 significativo para el análisis.
Resultados
Penetración estromal corneal
En la tabla I se exponen las concentraciones (µgr/ml) de ciprofloxacino obtenidas en el parénquima corneal en los diferentes grupos del estudio.
Los niveles de antibiótico en córnea, fueron superiores en todos los grupos del estudio (Grupos 2, 3, 4 y 5) que presentaban defecto epitelial, respecto al grupo control (Grupo 1) (p<0,001). Los defectos del 25% de la superficie epitelial han demostrado aumentar la penetración intraestromal de ciprofloxacino 4 veces respecto a la existencia de un epitelio íntegro. Este aumento se eleva a 7 veces cuando la extensión del defecto es del 50%. Los desbridamientos superiores al 50% (75% y 100%) no han demostrado un efecto adicional relevante, en la penetración corneal de ciprofloxacino.
En el análisis estadístico realizado entre los grupos que presentaban desbridamientos epiteliales (Grupos 2, 3, 4 y 5), se detectaron diferencias significativas entre los grupos 3, 4 y 5 (50, 75 y 100%, respectivamente) con respecto al grupo 2 (25%) (p<0,001). Sin embargo, no se detectaron diferencias entre los grupos 3, 4 y 5.
En la figura 1 se muestra la curva de regresión polinómica de las concentraciones de ciprofloxacino intraestromales con relación al área de defecto epitelial.
Fig. 1
Penetración cámara anterior
La penetración de ciprofloxacino a nivel de la cámara anterior, ha presentado un patrón similar.
La presencia de un defecto epitelial (Grupos 2, 3, 4 y 5) determinó unos niveles de antibiótico en humor acuoso superiores a los obtenidos en el grupo control (Grupo 1) (p<0,001) (tabla II). Los defectos del 25% de la superficie epitelial aumentan la penetración de ciprofloxacino 2 veces con respecto a la existencia de un epitelio íntegro, siendo este aumento de 4 veces, cuando la extensión del defecto es del 50%.
En el análisis de los grupos con defecto epitelial (Grupos 2, 3, 4 y 5), las concentraciones determinadas, aumentan conforme aumenta el área de defecto, aunque las diferencias no fueron significativas entre los grupos 3, 4 y 5 (50, 75 y 100%, respectivamente).
En la figura 2 se muestra la curva de regresión polinómica de las concentraciones de ciprofloxacino en humor acuoso, con relación al área de defecto epitelial.
Fig. 2
Discusión
Es un hecho conocido que los defectos epiteliales aumentan la permeabilidad y penetración intraocular de las sustancias medicamentosas aplicadas de forma tópica. Estudios de fluorofotometría (3) han puesto en evidencia, aumentos en la penetración de fluoresceína a nivel de la córnea y cámara anterior, en presencia de disrupciones en el epitelio corneal. Sin embargo, estos trabajos estaban únicamente orientados a demostrar una mayor penetración intraocular determinada por la existencia de una alteración epitelial, no valorando el área del defecto epitelial existente, ni cuantificando las concentraciones obtenidas a nivel del estroma corneal y/o cámara anterior.
En nuestro estudio demostramos que la presencia de defectos epiteliales aumenta las concentraciones intraoculares de ciprofloxacino, aplicado de forma tópica. La relación entre el tamaño del defecto epitelial y la penetración intraocular no sigue un patrón lineal, obteniéndose un límite en el área de defecto epitelial, situado en torno al 50% de la superficie total. Desbridamientos epiteliales de mayor extensión no determinan un efecto adicional en la penetración intraocular, obteniéndose unas concentraciones similares tanto en el estroma corneal como a nivel de la cámara anterior.
En la práctica clínica, existen situaciones susceptibles de beneficiarse de un desbridamiento de la superficie corneal, en un intento de aumentar la penetración intraocular de sustancias antimicrobianas, a nivel del estroma corneal y cámara anterior (4). Determinados procesos infecciosos, principalmente de etiología fúngica, comprometen de forma primaria al estroma corneal, sin compromiso epitelial. La integridad epitelial condiciona una resistencia a la eficacia terapéutica, debido a la barrera que constituye, obteniéndose bajas concentraciones farmacológicas intraoculares.
Las características lipofílicas del epitelio corneal, limitan la penetración de sustancias hidrofílicas. La utilización de agentes químicos favorecen la penetración de sustancias medicamentosas, en base a la alteración que provocan en el sistema de transporte intercelular del epitelio corneal. Pfister y cols. demostraron alteraciones ultraestructurales tales como la pérdida de microvellosidades, la alteración de membranas celulares y la creación de "orificios epiteliales" utilizando productos como el timerosal o el EDTA sódico (5,6). De forma alternativa, los desbridamientos epiteliales permiten modificar las características farmacocinéticas de las sustancias aplicadas de forma tópica, obteniéndose concentraciones intraoculares superiores.
En la actualidad, estudios farmacocinéticos, han demostrado cómo la aplicación de ciprofloxacino tópico, determinaba penetraciones intraoculares variables en presencia de un epitelio íntegro, observándose en determinados casos, concentraciones intraoculares que no alcanzaban la concentración mínima inhibitoria (CIM90) óptima para determinados gérmenes Gram positivos. La presencia de un defecto epitelial aumentaba la penetración intraocular, excediéndose la CIM90 para la mayoría de los patógenos corneales (2,7,8).
Resumen
Objetivo. Determinar la relación existente entre la integridad del epitelio corneal y la penetración intraocular de Ciprofloxacino, en un modelo animal.
Material y métodos. Se han utilizado conejos pardos pigmentados, divididos en 5 grupos de estudio: A/ Grupo 1 (n=9) epitelio corneal íntegro (grupo control). B/ Grupo 2 (n=9): Defecto epitelial del 25% de la superficie corneal. C/ Grupo 3 (n=9): Defecto epitelial del 50%. D/ Grupo 4 (n=9): Defecto epitelial del 75%. E/ Grupo 5 (n=9): Defecto epitelial del 100% de la superficie corneal.
Se realizaron instilaciones de Ciprofloxacino tópico al 0,3 % cada dos horas, hasta completar un total de 6 horas. Se obtuvieron muestras de humor acuoso (HA) y botones corneales, cuantificándose la actividad antiobiótica de las diferentes muestras oculares mediante la técnica de bioensayo.
Resultados. El desbridamiento del epitelio corneal aumentó la concentración de Ciprofloxacino a nivel del estroma corneal y en humor acuoso (p<0,001). Existe un nivel máximo de penetración, obtenido con desbridamientos del 50% de la superficie epitelial.
Conclusiones. La ruptura de la barrera epitelial corneal favorece la penetración de Ciprofloxacino en el polo anterior. Los defectos del 50% de la superficie, determinan el máximo nivel de penetración antibiótica. Disrupción de la integridad epitelial incrementa la liberación antibiótica en el segmento anterior.
Palabras Clave
Ciprofloxacino, farmacocinética, córnea, humor acuoso, fluorquinolonas, bioensayo.
Summary
Purpose. To determine the relationship between corneal epithelial defect and Ciprofloxacin penetration in an animal model.
Methods. Pigmented rabbits were randomized into five groups: A/ Group 1 (n=9): intact epithelium eyes (control). B/ Group 2 (n=9): 25% epithelial area debrided. C/ Group 3 (n=9): 50% epithelial area debrided. D/ Group 4 (n=9): 75% epithelial debrided. E/ Group 5 (n=9): total debridement.
0.3% topical Ciprofloxacin was applied every two hours (three times). Cornea and aqueous humor were obtained and the antibiotic was measured using bioassay.
Results. Removal of corneal epithelium increased corneal and aqueous Ciprofloxacin concentration (p<0.001). There was a maximum penetration level around 50% of epithelial debridement.
Conclusion. Debridement of corneal epithelium fosters Ciprofloxacin penetration into the rabbit cornea and aqueous humor. Removal of 50% of corneal epithelium results in maximum drug penetration. Loss of epithelial integrity could increase drugs delivery into anterior segment.
Key word
Ciprofloxacin, pharmacokinetic, cornea, aqueos humor, fluorquinolones, bioassay.
Bibliografía