REVISIÓN
Dres. Sanz AI1, Rivas L1, Murube J2
(1) Laboratorio de Dacriología. Servicio de
Oftalmología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
(2) Facultad de Medicina. Universidad de Alcalá de Henares. Madrid.
Conceptos básicos. Superficie ocular
La expresión de mucina y la ausencia de queratinización de las células epiteliales no secretoras representa la última etapa de diferenciación normal del epitelio de la superficie ocular. Este proceso está acompañado por la descamación celular como resultado de la apoptosis. Además, esta diferenciación debe estar compensada por la proliferación de células progenitoras basales para mantener la salud y el volumen del epitelio ocular (1).
Epitelio corneal
El epitelio corneal se renueva completamente en aproximadamente siete días. En un principio, se pensó que el epitelio corneal se regeneraba a partir de sus células basales, pero mediante estudios realizados en la década pasada se pudo establecer que las células stem (madres) del epitelio corneal se localizaban en el limbo (1). Este concepto propone que las células stem limbales son la última fuente de regeneración de las células epiteliales corneales, gracias a un suministro continuo de células de larga vida y a la migración centrípeta de células de tránsito amplificadas. Estas células stem crean también la barrera física de unión limbal por medio de la migración suprabasal, donde genera células postmitóticas, de igual forma, previenen la migración epitelial conjuntival hacia la superficie corneal, en casos donde existe un defecto total del epitelio corneal (2). Esto tiene gran importancia en la patología de la superficie ocular, y permite el planteamiento de nuevas técnicas de transplante de limbo.
Epitelio limbal
El limbo es una zona de transición entre el epitelio corneal y el conjuntival. Este epitelio consta de más de diez capas de células, siendo el epitelio más grueso de toda la superficie ocular. Su expresión fenotípica es intermedia entre las de los epitelios de la córnea y la conjuntiva. Entre las células epiteliales limbales hay abundantes melanocitos y células de Langerhans y carece de células caliciformes. Bajo el epitelio hay una rica red vascular, a partir de la que se supone le llegan los factores humorales reguladores.
Clínicamente, se puede observar que la fuente de proliferación y la migración de células epiteliales pigmentadas, después de sanar un defecto epitelial de la córnea periférica, que van desde el limbo hacia el centro de la córnea. Según este fenómeno, se supuso que la estructura papilar limbal es la generadora de las células epiteliales corneales (3-5); más tarde, varios estudios sugirieron que las células limbales emigran centrípetamente para reparar pérdidas epiteliales traumáticas (5). Sobre estos hallazgos, se elaboró la hipótesis X, Y, Z para explicar cómo se genera y mantiene la masa epitelial corneal (6). Más tarde, se observó que en el recambio epitelial normal hay también un movimiento celular centrípeto (6), y basándose en la expresión de una queratina de 64 Kd específica de córnea se observó que las células stem del epitelio corneal están en el limbo (7). Posteriormente, otros autores llegaron a la misma conclusión, basándose en la incorporación de timidina tritiada en las células basales córneo-limbales bajo la estimulación de un promotor tumoral (8).
Células stem del limbo como fuente de regeneración corneal
Actualmente, la suposición de que las células stem del epitelio corneal están en el limbo se basa en:
1. Las células basales del limbo son morfológicamente y bioquímicamente primitivas. Mediante el uso del anticuerpo monoclonal 4G10.3, específico para células en estado basal primitivo con alto potencial proliferativo. En ojos de ratas recién nacidas se observó que este anticuerpo se unía a las células de la capa basal del limbo y de la córnea en los estados tempranos del desarrollo de estos animales. Posteriormente, las células marcadas permanecen en el limbo y córnea dando lugar al epitelio maduro. La maduración epitelial de la córnea, que incluye cambios en la forma celular, estratificación epitelial y pérdida de la unión intercelular, ocurre en primer lugar en la córnea central y después progresa hacia la periferia, sin llegar a afectar a las células basales limbales (9).
Todas las células epiteliales corneales y limbales exceptuando las células basales limbales se unen al anticuerpo monoclonal AE5, que es específico para la queratina de 64 Kd y que es un marcador específico de estados avanzados de diferenciación del epitelio corneal. Esto significa que las células basales limbales son primitivas (7). Usando técnicas inmunohistoquímicas para anticuerpos contra queratinas, se encontró heterogeneidad regional que indicaba que las regiones limbales superiores e inferiores tienen el mayor número de células stem, y que producen el reemplazo de las células epiteliales (10).
2. Las células de renovación lenta, que sólo aparecen en los tejidos de renovación lenta, se encuentran en la capa basal del epitelio límbico, pero no en la córnea central. La administración de 3H-TdR a las células stem, hace que estas células de ciclo lento retengan el isótopo por un período largo de tiempo, y de aquí en adelante pueden ser identificadas como células etiquetadas-conservadas. Estas células pueden ser identificadas en la capa basal del limbo pero no en el epitelio central de la córnea, y pueden ser inducidas a proliferar y a llegar a ser etiquetadas después de una estimulación prolongada. Estas células aparentemente regresan a su estado previo de ciclo lento, una vez que la estimulación externa ha desaparecido, porque retienen la etiqueta durante un período largo de tiempo (8). En otro experimento se encontró que el 5-fluorouracilo era capaz de inhibir el crecimiento rápido de las células epiteliales del centro y periferia corneal, pero no en el de las limbales (11).
3. Las células limbales tienen un gran potencial de división. Se determinó que las enzimas sodio-ATPasa y la anhidrasa carbónica estaban presentes sólo en la región del limbo (12), y que el epitelio limbal tiene un valor mitótico más alto que el epitelio periférico, con una tasa más alta en el epitelio periférico que en el de la córnea central (13,14). Posteriormente, se investigaron las diferencias metabólicas usando 3-1-P, indicando que hay una actividad alta de las enzimas metabólicas en el epitelio periférico, especialmente en el área limbal, más que en el epitelio central, durante la reepitelización y en condiciones normales (15).
4.células epiteliales periféricas de la córnea se desplazan centrípetamente. Se observó que las células epiteliales de la córnea periférica de rata, marcadas con partículas de carbono, emigran centrípetamente y muestran que este movimiento celular ocurre incluso en una córnea normal (4).
5. Las células de transición entre el limbo y la córnea periférica tienen un fenotipo similar al de las del limbo. Las células epiteliales corneales y limbales sintetizan el mismo conjunto de queratinas (abundantes marcadores K3/K12 de diferenciación epitelial corneal), lo que indica que ambos epitelios se relacionan estrechamente (16).
6. En la reparación de las heridas epiteliales de la córnea aparece proliferación celular en el limbo adyacente. Se observó que en el epitelio limbal y corneal regenerado, aumentaban continuamente de espesor después de sanar y no mostraban ninguna célula caliciforme en ninguna etapa de la curación (17). Después de producirse la herida, los antígenos nucleares de proliferación celular se expresaban tempranamente en el epitelio limbal y más tarde en la capa basal del epitelio corneal regenerado (18). Estos hallazgos fueron apoyados por otros autores que indicaron que la expresión de la alpha-enolasa estaba elevada durante la migración del epitelio corneal y que se iniciaba desde la población de células stem. La expresión estaba vinculada a la migración activa; además, parecía que las células limbales eran metabólicamente activas durante el período del movimiento, mientras que las células basales de la córnea periférica permanecieron activadas durante cuatro semanas después de producirse la herida, como células de transito amplificadas (19).
Algunos hallazgos sugirieron que las células epiteliales bajo condiciones de estrés o daño podrían, preferentemente, activar indirectamente las células epiteliales stem limbales, por medio de fibroblastos, así como poder estimular la inflamación durante el período de cicatrización de la herida (20).
7. Los transplantes limbales regeneran el epitelio corneal. Un traslado incompleto del epitelio basal conduce a córneas avascularizadas con transdiferenciación conjuntival. Inversamente, el traslado completo de tales células provoca una vascularización innata del epitelio corneal y conjuntival, lo que demora la curación. En la diferenciación parcial del limbo el epitelio corneal está también comprometido, especialmente cuando se quita una masa grande de células epiteliales (21,22).
Las células limbales cultivadas pueden funcionar como injertos que, permanentemente, restauran el epitelio de la córnea después de un daño severo en la superficie ocular. También, se estudió que los transplantes limbales regeneran el epitelio pseudocorneal (23,24).
La razón por la que las células stem del epitelio corneal se localizan en el área limbal puede ser debido a: que allí tienen un rico soporte vascular, que allí pueden estar muy pigmentadas, como de hecho lo están, para protegerse de las radiaciones actínicas (25); también actúan de barrera de protección cuando hay una herida corneal, para impedir que las células conjuntivales invadan la córnea para repararla (26).
Células stem en la conjuntiva
Todavía no se conoce si las células stem también existen en el epitelio conjuntival y si estas células stem son comunes para las células epiteliales caliciformes y las no-caliciformes. Hasta el momento se conocen dos posibles teorías sobre la localización de las células stem conjuntivales: la teoría fornical sostiene que están localizadas en el fondo del fórnix conjuntival, desde donde se desplazan hacia la conjuntiva palpebral y hacia la conjuntiva bulbar. Esta teoría se basa en que las células epiteliales de esta zona tienen en el recién nacido gran actividad divisoria (27), y que poseen más células de renovación lenta que ninguna otra de la conjuntiva (21), y un potencial proliferativo muy superior al de las palpebrales y bulbares (28).
La teoría margo-limbal sostiene que las células conjuntivales proceden de dos orígenes, uno situado en la unión muco-cutánea del borde palpebral y otra en el área limbal pericorneal. Estas últimas, que se generan aquí, se desplazan y mueren en el limbo (29).
Las diferencias entre el linaje corneal y conjuntival
La idea de que el epitelio corneal y el conjuntival no son equipotentes es apoyado por las siguientes evidencias: el contenido de glucógeno y otras características bioquímicas del "epitelio corneal" derivado del epitelio conjuntival, permanece anormal mucho tiempo después de terminar el proceso de transdiferenciación. El "epitelio corneal" derivado de la conjuntiva puede responder formando células caliciformes y produciendo inmunoglobulina A, dos indicadores del epitelio conjuntival normal (30). Aunque mediante microscopia óptica, el epitelio corneal derivado de la conjuntiva aparezca normal permanecen, algunas células caliciformes y mediante microscopia electrónica se observa que este epitelio presenta espacios intercelulares mayores que en el epitelio corneal. En seres humanos, se encontró que el epitelio corneal derivado de conjuntiva se asocia frecuentemente con defectos epiteliales persistentes, erosión recurrente, neovascularización estromal, necrosis, y tasa de curación retrasada (31).
El hallazgo de que las células epiteliales de la córnea cultivadas sintetizan queratina diferente del modelo de queratina producida por los queratinocitos conjuntivales cultivados (bulbar, fórnix, y palpebral), proporciona evidencia clara que el epitelio córneo-limbal es intrínsecamente diferente del conjuntival.
Los estudios que analizaron la diferenciación en vivo de células epiteliales conjuntivales, corneales y limbales cultivadas, proporcionan las evidencias más fuertes que apoyan esta idea (31).
Enfermedades de la superficie ocular caracterizadas por la deficiencia limbal
Cuando las células stem limbales están en un estado disfuncional (deficiencia limbal) dan lugar a un estado patológico con manifestaciones comunes a una epitelización pobre (defectos persistentes o erosiones recurrentes), inflamación estromal crónica (queratitis mezclada con cicatrización), vascularización de la córnea y el no-desarrollo del epitelio conjuntival (conjuntivalización). La displasia y neoplasia de la superficie ocular son conocidas por tener una predilección limbal (2). Esto también explica porqué no ha sido posible crear epitelización retardada o defectos corneales epiteliales persistentes en animales sin dañar el limbo córneo-escleral (32). Una extirpación incompleta de las células basales del limbo explica porqué tiene lugar una errónea "transdiferenciación conjuntival" (33).
Cuando el grosor total del epitelio limbal está completamente dañado (33,34) o cuando una parte del epitelio limbal es extirpado (35,36), se produce un espectro de superficie corneal anormal. Todos ellos se caracterizan por una prolongación del crecimiento interno del epitelio conjuntival (conjuntivalización), vascularización, inflamación crónica, pobre integridad epitelial manifestada como superficie irregular, erosión recurrente, úlcera persistente, destrucción de la membrana basal y crecimiento interno de fibras. A la vez, hay signos de deficiencia limbal; entre los que destaca la conjuntivalización (37).
Pacientes con deficiencias limbales sufren frecuentemente disminución de la visión y, generalmente, son pobres candidatos para el transplante corneal convencional, ya que sólo presenta células de amplificación de tránsito corneal de vida corta; además, si preexiste vascularización corneal e inflamación, el riesgo de rechazo se incrementa (1).
Estas enfermedades corneales pueden ser divididas en dos categorías principales: pérdida de la población de células stem limbales a causa de su destrucción y disfunción del medio ambiente estromal de las células stem limbales (37). La pérdida de población de células stem se caracteriza por tener una clara causa patogénica identificable. Esta destrucción puede ser por quemaduras o daños químicos o térmicos, síndrome de Stevens-Johnson, múltiples operaciones o crioterapias en la región limbal, queratoplastia inducida por lentes de contacto o infecciones microbianas severas. Las enfermedades que se caracterizan por la disfunción limbal incluyen diversas causas como aniridia, queratitis asociadas con deficiencias endocrinas múltiples, queratopatías neutrófica, inflamación periférica, queratitis ulcerativa o limbitis, queratopatía idiopática y pterigión (37).
No hay relación entre las enfermedades caracterizadas por la pérdida de células stem limbales y las que sufren una destrucción del limbo, pero todas ellas exhiben una gradual pérdida de la función de las células stem limbales. Estos descubrimientos sugieren que la función de las células stem limbales puede ser modulada por factores de desarrollo, hormonales, neuronales, vasculares e inflamatorios en el medio ambiente limbo-estromal.
Sería necesario la realización de nuevos estudios para explorar el mecanismo por el cual funciones de células stem limbales son reguladas por su medio ambiente estromal (1).
Aplicación de las células stem en el transplante
El concepto de células stem limbales ha ayudado a potenciar un nuevo procedimiento quirúrgico llamado transplante limbal (38), que es más eficaz para la restauración de la superficie corneal que el transplante conjuntival (39). Clínicamente, los autoinjertos limbales han reconstruido satisfactoriamente las superficies corneales de pacientes con enfermedades con pérdida de la población de células stem limbales, especialmente los que tienen deficiencia limbal unilateral o focal (38,40-43). Para pacientes con deficiencia limbal difusa y bilateral, la reconstrucción de la superficie corneal se realiza mediante donantes o cadáveres (43-45). Recientemente, las células stem del epitelio conjuntival han sido localizadas en la región del fórnix (46), por lo que los posibles transplantes conjuntivales se deberían centrar en la obtención de células de esta región. Por otro lado, se necesita realizar nuevos estudios para determinar si la reconstrucción corneal puede ser también llevada a cabo por las células de la superficie conjuntival, si se confirmase la existencia de células stem por toda la conjuntiva.
Nuevos métodos de transplante
Un nuevo método cada vez más extendidos es restaurar la membrana basal destruida y la matriz estromal dañada por medio del uso del transplante de membrana amniótica (47). Este método puede ser usado para restaurar el microambiente estromal de células stem limbales, un mecanismo importante para enfermedades que han sufrido una destrucción limbal. Los pocos datos obtenidos hasta ahora indican que, este procedimiento es efectivo en la reconstrucción de la superficie corneal en pacientes con ojo seco severo y secundario a penfigoide cicatricial ocular y síndrome de Stevens-Johnson (48). Junto a la deficiencia limbal, el transplante de membrana amniótica puede ser también usado para restaurar el microambiente estromal de las células de amplificación de tránsito corneal. Por ejemplo, es útil para tratar pacientes con defectos epiteliales corneales refractarios y persistentes y ulceración (49).
Esta teoría de reemplazamiento de la matriz puede ser también usada para sostener células epiteliales conjuntivales. Esto puede sustituir autoinjertos conjuntivales en pterigión y para reconstruir superficie de la conjuntiva después de extirpar tumores, cicatrices y simblefaron (50,51). La superficie reconstruida generalmente muestra una restauración del fenotipo conjuntival normal, una rápida epitelización, inflamación reducida, reducida cicatrización y mayor densidad de células caliciformes (52), es probable que las células stem conjuntivales también se mantengan. Es necesario seguir investigando para determinar el mecanismo de acción de conservación de la membrana amniótica y cómo se podría utilizar esta técnica para tratar otras enfermedades de la superficie ocular.
Resumen
Cuando las células stem limbales están en un estado disfuncional dan lugar a manifestaciones patológicas comunes a: una pobre epitelización, inflamación crónica, vascularización de la córnea y no desarrollo del epitelio conjuntival.
Existe una hipótesis acerca de la renovación del epitelio corneal y conjuntival: en ambos epitelios las células proceden de dos células stem diferentes que dan lugar a dos vías de diferenciación o a dos genealogías distintas.
La aplicación del transplante de células stem debería ser realizado de forma rutinaria en los ojos con enfermedades corneales para reconstruir la superficie ocular en enfermedades oculares avanzadas, mediante el transplante limbal allógrafo, el transplante de membrana amniótica y la tarsorrafia; bien de forma individual o combinada.
Summary
When limbal stem cells are in a dysfunctional state, they go from common pathological manifestations to: poor epithelization, chronic stromal inflammation, vascularization of the cornea, and non-development of the conjunctive epithelium.
There is an hypothesis about the renovation of the corneal and conjunctive epithelium: in both, the cells proceed from two different cell stems that generate two differentiation pathway or genealogies.
Application of stem cell transplants should be performed in a routine way on eyes with corneal diseases. Allographic limbal transplant, amniotic transplant and tarsorrhaphy, either individually or combined, can reconstruct the ocular surface in advanced ocular diseases.
Bibliografía