(1) Servicio de Oftalmología. Hospital Universitario La Fe de Valencia.
(2) Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de Valencia. Universidad de Valencia.
(3) Profesor Titular de Oftalmología. Universidad del País Vasco.

El ketorolaco, AINE no comercializado en nuestro país en colirio y aprobado por la FDA únicamente para la terapia sintomática de la conjuntivitis alérgica estacional, a nivel ocular sólo ha sido ensayado en conjuntivitis alérgicas (1,2) e inflamación postquirúrgica de la cirugía de la catarata (3-5); no existiendo estudios sobre su eficacia en el campo de las uveítis.

El flurbiprofeno, AINE aprobado por la FDA sólo para la inhibición de la miosis intraoperatoria (6), ha mostrado eficacia sobre la prevención de la miosis en la cirugía de la catarata, en queratitis experimentales (7) y en modelos de inflamación conjuntival inducidas por ácido araquidónico (8). No ha sido ensayado sobre uveítis establecidas, experimentales o no.

Se pretende realizar un estudio comparativo entre esteroides y AINES no ensayados anteriormente en el tratamiento de las uveítis con eficacia demostrada en otros campos, ya que podrían abrirse nuevas perspectivas de futuro en el tratamiento de la inflamación ocular.

Sedación-anestesia. Tras inyectar en la pata trasera una dosis de 35 mg/kg de la mezcla de Prometazina (Frinova®) y Clorhidrato de Ketamina (Ketolar®), se realizó anestesia tópica previa a la inyección intravítrea de endotoxina con clorhidrato de oxibuprocaína y tetracaína (colirio anestésico doble Cusí®) en el fondo de saco conjuntival inferior.

La endotoxina. Se empleó el lipopolisacárido A de la pared bacteriana de Salmonella Typhimurium (Sigma Chemical Co®). La dosis a inyectar fue de 1.000 ng disueltos en 0,1 ml de suero fisiológico estéril. La vía de administración elegida fue la intravítrea.

Técnica de inyección intravítrea. Se realizó en el cuadrante temporal superior a 3 mm del limbo con una jeringuilla de insulina y una aguja de 30 G. Antes de inyectar la endotoxina, con la aguja insertada en el vítreo, se practicó una paracentesis con aguja de 30 G extrayéndose 0,1 ml de acuoso. Tras ello, se inyectó 0,1 ml de la solución previa (1.000 ng de endotoxina) lentamente en el centro de la cavidad vítrea. Al retirar la aguja se aplicó en la zona de punción una hemosteta para evitar el posible reflujo de la solución.

Distribución de los grupos de animales. Los conejos se distribuyeron en 6 grupos de 10 animales, realizándose exámenes sobre el ojo derecho, permaneciendo el ojo izquierdo libre de endotoxina y tratamiento. La terapia antiinflamatoria consistió en la instilación, a las 20 horas de inducir la uveítis, de un total de 6 gotas (1 gota/30 minutos) en el fondo de saco conjuntival inferior de los diferentes fármacos. La extracción de muestras se realizó a las 24 horas de la inducción de la uveítis. La distribución fue la siguiente: Grupo I (endotoxina más suero fisiológico apirético Grifols®); Grupo II (acetato prednisolona 1%=Pred Forte®); Grupo III (ketorolaco trometamina 0,5%=Acular®); Grupo IV (flurbiprofeno sódico 0,03%=Ocuflur®); Grupo V (fluorometolona alcohol 0,25%=FML Forte®) y Grupo VI (control sin endotoxina ni tratamiento).

Cuantificación de parámetros inflamatorios. La extracción de acuoso (tras el sacrificio del animal) se efectuó a las 24 horas, valorándose la celularidad inflamatoria, la concentración proteica y el MDA (malonil dialdehído) del siguiente modo:

• Celularidad inflamatoria. Con una microjeringa de Hamilton (Reno, Nevada) se tomaron 2 gotas de acuoso de 1 µl, que se depositaron sobre un portaobjetos, procediéndose a su tinción y cuantificación. La técnica de tinción empleada fue la "Tinción Rápida de Grifols" (Diagnostic Grifols S.A.), sistema panóptico rápido similar a la tinción de Wright-Giemsa, que se emplea habitualmente en citología (9). La cuantificación se efectuó de un modo similar a otros autores (10,11); se tomaron 4 fotografías de cada µl a 10 aumentos, realizándose una fotocomposición de forma que ésta englobase la totalidad del microlitro a estudiar.
• Determinación de proteínas. Para ello se empleó humor acuoso previamente almacenado en tubos Eppendorf heparinizados y congelados a 20·C. Se valoró el contenido proteico mediante el método de Lowry (12), con modificaciones empleadas por el Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de Valencia
• Determinación de M.D.A. Para ello se empleó un equipo de HPLC 325 System y un detector ultravioleta visible HPLC-Detector 332 (Kontron). La columna de separación empleada fue una Spheryc-5, ODS 5 µ, de 250x4,6 mm (Brownlee-Colums), mientras que la longitud de onda fue de 532 nm y el flujo de fase móvil de 1,0 ml/min. La inyección de cada muestra en el aparato de HPLC se realizó con una microjeringa de Hamilton de 50 µl (Reno, Nevada). El método empleado es una modificación del procedimiento de Richard (13).

Fig. 1

Resultados de la celularidad en acuoso. Todos los grupos mostraron diferencias estadísticamente significativas al ser comparados con el grupo de endotoxina empleando el test de la "t de Student" (p<0,001). El análisis de la varianza de un factor (ANOVA ONEWAY) muestra que la variabilidad entre los 4 grupos es estadísticamente significativa. El test a posteriori de Tuckey agrupó los tratamientos en función de su eficacia en 3 grupos: 1.º acetato de prednisolona; 2.º fluorometolona; 3.º flurbiprofeno y ketorolaco.

Fig. 2

Resultados de la determinación de proteínas. Los esteroides mostraron diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo de endotoxina empleando el test de la t-Student (p<0,001). Los AINES no mostraron significación estadística [flurbiprofeno (p=0,004) y ketorolaco (p=0,001)].

Fig. 3

Resultados de la determinación de MDA. Todos los grupos objetivaron disminución del MDA respecto al grupo endotoxina, aunque no de forma estadísticamente significativa. El flurbiprofeno muestra la menor reducción de MDA con un valor de 0,285±0,04 µl/M.

Fig. 4

Fig. 5

Se han demostrado descensos significativos de celularidad inflamatoria en acuoso con esteroides en colirio (dexametasona 0,1% y B-metasona 0,1%) (15,16). Por el contrario, AINES como la indometacina no han sido capaces de reducir la inflamación, aumentándola incluso paradójicamente en algunos estudios (17). Tan sólo se ha demostrado un AINE que no aumente la celularidad en acuoso, el diclofenaco sódico, el cual a dosis elevadas es capaz de revertir la dirección del metabolismo del ácido araquidónico, incluso tras inocular en acuoso un agente quimiotáctico (18). La explicación a este hecho podría justificarse por las características intrínsecas de los AINES de ser "inhibidores de la vía de la ciclooxigenasa", mecanismo que bloquearía en parte la metabolización del ácido araquidónico por esta vía, derivándose tal metabolismo por la vía de la lipooxigenasa (vía con propiedades principalmente quimiotácticas), lo cual incrementaría la síntesis de lipoderivados que secundariamente aumentarían la actividad quimiotáctica celular y la celularidad en acuoso.

En nuestro estudio (19), los AINES, se muestran como los fármacos con menor capacidad de reducir la celularidad inflamatoria en humor acuoso, mostrándose aproximadamente 4 veces menos potentes que el acetato de prednisolona. El ketorolaco es el fármaco con la menor reducción de celularidad del estudio (4310,70±526,60 cél/µl), valor muy similar al flurbiprofeno (4000,80±468,78 cél/µl). Este resultado es explicable en parte por el "transvase" de la degradación del ácido araquidónico hacia la vía de la lipooxigenasa que desemboca en la síntesis de leucotrienos que son los factores quimiotácticos celulares por excelencia. No hemos constatado incrementos de celularidad en acuoso con los AINES empleados, en contraposición a los aumentos reseñados con la indometacina (17). Se puede afirmar que en el modelo de UIE, tanto ketorolaco como flurbiprofeno son poco útiles como reductores de la celularidad inflamatoria a pesar incluso de que en el conejo la vía de la lipooxigenasa es poco importante (20). Esto contrasta con dos estudios comparativos entre ketorolaco 0,5% y prednisolona 0,1% que muestran la no existencia de diferencias entre estos fármacos en la efectividad de la reducción de la celularidad en acuoso (4,5). En nuestro trabajo esto claramente no sucede así, cabiendo además oponer al respecto que en estos estudios la concentración de acetato de prednisolona empleada fue 10 veces inferior a la utilizada por nosotros (19). De igual modo contrasta con los trabajos de Jaramillo que muestran una reducción de la celularidad con flurbiprofeno del 57%, lo que le hace cuestionarse un posible papel secundario de la vía de la ciclooxigenasa en tal reducción celular (21). En nuestro estudio, la reducción celular conseguida con los AINES fue del 39,93% con el flurbiprofeno y del 34,50% con el ketorolaco (19).

Tal vez los resultados desalentadores del ketorolaco pudieran deberse a problemas en su penetración ocular en los diferentes tejidos; hecho no confirmable por existir escasos estudios en la literatura internacional. Un estudio con el factor de necrosis tumoral como mediador del proceso inflamatorio muestra concentraciones del fármaco en acuoso pero no en vítreo ni en el ojo contralateral (22). Otro estudio sobre conejos muestra una penetración en acuoso del ketorolaco trometamina 10 veces superior a la vítrea (23).

Los resultados de la valoración proteica en la cámara anterior constituyen el más fiel reflejo de la cuantía de rotura de la barrera hematoacuosa que se produce durante el proceso inflamatorio. Se han realizado numerosos estudios con esteroides y AINES sobre la reducción de la concentración de proteínas en humor acuoso durante el proceso inflamatorio, demostrándose descensos con diferentes fármacos: b -metasona tópica 0,1% (24), dexametasona colirio 1%, dexametasona sistémica, indometacina (24,25) y flurbiprofeno (25). En estos estudios se ha constatado un efecto similar entre indometacina y flurbiprofeno (24,25).

La reducción proteica, y por tanto estabilización de la barrera hematoacuosa, parece deberse a la "inhibición de la vía ciclooxigenasa" y al efecto de las prostaglandinas sobre el receptor específico EP2 (26), localizado en el cuerpo ciliar (46%) e iris (37%) (27). De igual modo se ha demostrado un papel relevante del PAF en el incremento proteico durante este modelo, habiéndose demostrado reducciones proteicas con antagonistas del PAF (28).

En nuestro estudio (19), los AINES son los fármacos menos eficaces como reductores de la concentración proteica del estudio. El acetato de prednisolona 1% es el fármaco que revela un mejor establecimiento de la barrera hemato-acuosa; es capaz de restablecer la integridad de esta barrera en un 35,57%. Por contra, el ketorolaco, que se muestra como el peor producto del estudio tan sólo lo hace en el 17,48% y el flurbiprofeno en el 17,97%, lo cual refleja claramente la superioridad de los esteroides también en este aspecto inflamatorio.

Diversos tejidos oculares poseen en su estructura ácidos grasos poliinsaturados, en cantidades manifiestas; por ello, desequilibrios "red-ox" pueden desencadenar el catabolismo lipoperoxidativo, proceso por el que los ácidos grasos se transforman entre otras sustancias en aldehídos. Por esto se analizaron los niveles de peroxidación del acuoso con un método novedoso de HPLC para cuantificar malonil dialdehído (MDA) (13).

Existe un "feed back" positivo entre radicales libres y la actividad ciclooxigenasa a nivel coroideo y retiniano tras la hipertensión sistémica experimental, habiéndose demostrado que la vía ciclooxigenasa genera prostanoides y radicales libres (29). Los inhibidores de la ciclooxigenasa, ibuprofén e indometacina, reducen marcadamente los niveles de prostanoides y previenen los incrementos de MDA durante la hipertensión sin modificarlos durante la normotensión (29), pudiendo ejercer su acción sobre la vía ciclooxigenasa, no directamente sobre la formación de lipoperóxidos.

Por ello, los AINES de nuestro estudio deberían reducir los niveles de MDA de forma manifiesta. Sin embargo, aunque todos los grupos disminuyen el MDA, la menor reducción se aprecia con el flurbiprofeno (0,285±0,04 µl/M), sin existir explicación aparente para este hecho. Paradójicamente, y tal como sucede con otros AINES como la indometacina (30), la mayor reducción de MDA ocurre con el ketorolaco (0,180±0,04 µl/M). La poca significación estadística es debida a las altas exigencias del protocolo estadístico (99%). Si los resultados se aplicaran para un nivel de significación menor (p<0,05), también serían estadísticamente significativos el acetato de prednisolona y el ketorolaco.